一種過表達(dá)CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1細(xì)胞株及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種過表達(dá)CADM1的骨肉瘤 U-20S-CADM1細(xì)胞株及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨肉瘤的致病機(jī)制是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，是多種抑癌基因與致癌基因的失衡所 致。細(xì)胞黏附分子l(Cella化esionmoleculeLCADM1)是Kuramochi等在2001年研究肺 癌時(shí)，通過功能性互補(bǔ)的方法鑒別出的新的腫瘤抑制因子。CADM1定位于染色體llq23. 2， 跨度大于30化P，含有10個(gè)外顯子，由4. 4化和1. 6化大小的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄體編碼同一種CADM1 蛋白。CADM1蛋白結(jié)構(gòu)上包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，胞外區(qū)含3個(gè)免疫球蛋白C2型結(jié)構(gòu) 域，與細(xì)胞黏附有關(guān)；跨膜區(qū)域?yàn)棣谅菪杷Y(jié)構(gòu)；胞內(nèi)區(qū)域含有兩個(gè)重要的蛋白結(jié)合模 序：PDZ結(jié)合模序和FERM蛋白結(jié)合模序。
[0003] 研究表明，CADM1廣泛參與細(xì)胞間黏附、運(yùn)動(dòng)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也 發(fā)揮著重要的作用，正常時(shí)起抑制細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生的作用，一旦其表達(dá)降低或缺失，貝U 失去對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及異常增生的陰性調(diào)節(jié)。
[0004]CADM1作為一種腫瘤抑制基因，在多種原發(fā)性腫瘤中表達(dá)減弱或缺失。目前，對于 CADM1與腫瘤的關(guān)系，現(xiàn)有的研究大多是集中在CADM1在各種腫瘤中的表達(dá)情況、與腫瘤惡 性程度及臨床表現(xiàn)的關(guān)系、在腫瘤早期診斷及預(yù)后中的作用等，而對于CADM1是如何抑制 腫瘤尤其是骨肉瘤等方面的研究較少，CADM1對于骨肉瘤的具體影響及作用機(jī)制仍然不明 確。由于CADM1在多種腫瘤包括骨肉瘤中的表達(dá)是明顯降低甚至是缺失的，而當(dāng)前又缺少 CADM1相關(guān)的生物試劑等，因而上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中CADM1的表達(dá)，構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)CADM1的 骨肉瘤細(xì)胞株，觀察過表達(dá)后的CADM1對于骨肉瘤細(xì)胞的作用，對于研究CADM1對于骨肉瘤 的影響和抑癌機(jī)制、W及研究CADM1對腫瘤的作用機(jī)制都是十分重要的。目前，尚未見到關(guān) 于構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)CADM1骨肉瘤細(xì)胞株的研究和報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種過表達(dá)CADM1的骨肉瘤 U-20S-CADM1細(xì)胞株，W突破現(xiàn)有的關(guān)于CADM1與骨肉瘤的研究方向，通過提高骨肉瘤 U-20S細(xì)胞中CADM1的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)CADM1對于骨肉瘤細(xì)胞U-20S的作用影響及抑制機(jī)制的 研究。本發(fā)明的另一目的在于提供上述過表達(dá)CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株的構(gòu)建 方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明提供的一種過表達(dá)CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株，所述細(xì)胞含有過 表達(dá)的CADM1，所述細(xì)胞是骨肉瘤細(xì)胞U-20S，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（中國湖北 省武漢市武漢大學(xué))，保藏編號為：CCTCCNO:C201518。
[000引本發(fā)明的另一目的通過w下技術(shù)方案予w實(shí)現(xiàn)：
[0009] 本發(fā)明提供的上述過表達(dá)CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株的構(gòu)建方法如下： 通過構(gòu)建含目的基因CADM1質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染骨肉瘤U-20S細(xì)胞，然后用嚷嶺霉素 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株而構(gòu)建得到過表達(dá)CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株。
[0010] 進(jìn)一步地，本發(fā)明構(gòu)建方法包括W下步驟：
[0011] (1)構(gòu)建含目的基因CADM1質(zhì)粒
[001引通過PCR獲得目的基因CADM1的片段，PCR采用的引物為：
[0013]上游引物：5' -ATGGCGAGTGTAGTGCTGCCG-3'（序列1)
[0014]下游引物：5'-GAAAGAGTACTTCATCTAG-3'（序列 2);
[0015]PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后作為外源DNA片段與包含0RF序列的質(zhì)粒載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩 選，通過PCR重組克隆，構(gòu)建得到CADM1質(zhì)粒；
[001引 0)慢病毒包裝
[0017]獲得目的基因慢病毒LP-S0406-LV201-400;
[001引 0)轉(zhuǎn)染和篩選
[0019]W目的基因慢病毒LP-S0406-LV201-400轉(zhuǎn)染骨肉瘤U-20S細(xì)胞，再用嚷嶺霉素濃 度2 μ g/ml篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，得到過表達(dá)CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株。
[0020] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0021] 本發(fā)明突破了現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于CADM1與骨肉瘤的研究方向，克服了目前缺乏用于研 究CADM1與腫瘤之間作用機(jī)制的CADM1相關(guān)生物試劑的問題，通過建立穩(wěn)定過表達(dá)CADM1 的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株，W此細(xì)胞株可直接研究CADM1對于骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用 和抑癌機(jī)制等，具有直觀、真實(shí)、可穩(wěn)定傳代等優(yōu)點(diǎn)，對于腫瘤治療技術(shù)的研究和發(fā)展具有 重要意義。
[0022] 下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述：
【附圖說明】：
[0023]圖1是本發(fā)明實(shí)施例目的基因質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖；
[0024] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例陽性對照質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖；
[00巧]圖3是本發(fā)明實(shí)施例骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株的細(xì)胞巧光圖（a:細(xì)胞照片 (1ms) ;b:巧光照片（Is));
[0026] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例對照病毒U-20S細(xì)胞株的細(xì)胞巧光圖（a:細(xì)胞照片（1ms);b: 巧光照片（Is));
[0027] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例Real-Time PCR檢測所得內(nèi)參-GAPDH的擴(kuò)增曲線圖；
[002引圖6是本發(fā)明實(shí)施例Real-Time PCR檢測所得內(nèi)參-GAPDH擴(kuò)增后的融解曲線分 析圖；
[0029] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例Real-Time PCR檢測所得目的基因-CAMD1的擴(kuò)增曲線圖；
[0030] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例Real-Time PCR檢測所得目的基因-CAMD1擴(kuò)增后融解曲線 分析圖；
[0031] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例Westernblot檢測所得內(nèi)參基因-GAPDH的蛋白表達(dá)情況 (36邸a)和目的基因-CAMD1的蛋白表達(dá)情況（約為48. 7邸a);
[0032] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例空白組、空載體組及轉(zhuǎn)染組Ξ組細(xì)胞的生長曲線圖；
[0033] 圖11是本發(fā)明實(shí)施例空白組、空載體組及轉(zhuǎn)染組Ξ組細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小 時(shí)后的侵襲圖片；
[0034] 圖12是本發(fā)明實(shí)施例空白組、空載體組及轉(zhuǎn)染組Ξ組細(xì)胞的遷移圖；
[0035] 圖13是本發(fā)明實(shí)施例裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)巧光示蹤成像圖（空載體組和轉(zhuǎn)染組）；
[0036]圖14是本發(fā)明實(shí)施例裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)巧光示蹤成像圖（空載體組和 轉(zhuǎn)染組）；
[0037]圖15是本發(fā)明實(shí)例裸鼠皮下成瘤和尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)巧光示蹤平均巧光密 度統(tǒng)計(jì)直方圖（空載體組和轉(zhuǎn)染組）；
[0038] 圖16是本發(fā)明實(shí)施例裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)組織切片肥染色（a:空載體組；b:轉(zhuǎn)染 組）；
[0039]圖17是本發(fā)明實(shí)施例裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)組織切片肥染色（a:空載體 組；b:轉(zhuǎn)染組）。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 圖1~圖17所示為本發(fā)明一種過表達(dá)CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株及其 構(gòu)建方法、W及骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株在體內(nèi)外功能檢測的實(shí)施例。本發(fā)明實(shí)施例通 過構(gòu)建含目的基因CADM1質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染骨肉瘤U-20S細(xì)胞，然后用嚷嶺霉素篩 選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株而構(gòu)建得到過表達(dá)CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株，于2015年3月 23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號為：CCTCCNO:C201518。
[0041] 一、構(gòu)建過表達(dá)CADMl的骨肉瘤U-20S-CADM1細(xì)胞株和對照病毒骨肉瘤U-2os細(xì) 胞株
[004引 （1)構(gòu)建質(zhì)粒
[004引通過PCR獲得目的基因CADM1的片段，PCR采用的引物為：
[0044]上游引物：5' -ATGGCGAGTGTAGTGCTGCCG-3'（見序列表中序列 1)
[0045]下游引物：5' -GAAAGAGTACTTCATCTAG-3'（見序列表中序列 2);
[0046] 然后用OMEGA的広Z.N.A.⑥切clePureKit純化PCR產(chǎn)物，純化PCR產(chǎn)物成功后 作為外源DNA片段與圖1所示包含0RF序列的質(zhì)粒載體連接：用虹-Fu玻m愈皿EcoDryTM CloningKit做In-化sion反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用移液器吸取5ul用于轉(zhuǎn)化；隨后進(jìn)行大腸桿 菌的轉(zhuǎn)化及重組菌的篩選、PCR法篩選基因重組克隆，用OMEGA的E.Z.N.A應(yīng)PlasmidMini KitI提取篩選后的質(zhì)粒DM、對質(zhì)粒DM進(jìn)行酶切及測序，得到含目的基因CADMl質(zhì)粒。
[0047] (2)病毒包裝
[0048] 方法如下：
[0049] (2-1)培養(yǎng)包裝細(xì)胞
[0050] 在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前，提前兩天將1. 3~1. 5Xl〇6的293T細(xì)胞移入10厘米細(xì)胞板進(jìn) 行培養(yǎng)，板內(nèi)加入10ml含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，使細(xì)胞在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到 70~80%融合率。在5%C〇2條件下，37°C培養(yǎng)細(xì)胞。通過包裝細(xì)胞使慢病毒質(zhì)粒增值。
[0051] (2_2)制備DNA-En