doFectin混合物
[0052] 往無菌EP管加入上述含目的基因CADMl的ORF/shRNA表達質粒2. 5μg、LentiPac HIV混合試劑（GeneCopoeia)5.ομ1WOpti-MEMI稀釋至 200μ1。在另一無菌EP管內，W化ti-MEMI稀釋15μ1化do化ctin轉染試劑（GeneCopoeia)。邊輕柔進行滿旋，邊往 DNA和LentiPacHIV試劑的混合溶液中滴加W上稀化do化ctin轉染試劑。室溫培養(yǎng)該溶 液10~25分鐘，使DNA-EndoFectin混合物產(chǎn)生。
[0053] (2-3)轉染包裝細胞
[0054] 將DNA-EndoFectin慢病毒復合物接加入細胞板，輕柔滿旋平板使復合物分散。細 胞在C〇2條件下，37°C過夜培養(yǎng)（8~14小時），W加入2~5%熱滅活胎牛血清、青霉素和 鏈霉素的新鮮DMEM培養(yǎng)基更換舊培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入1/500體積的Tite巧oost滴度增 強劑并繼續(xù)在C〇2條件下，W37°C繼續(xù)培養(yǎng)。轉染后的16小時內，替換含DNA-EndoFectin 慢病毒混合物的培養(yǎng)基。
[00巧](2-4)收獲慢病毒
[005引轉染48小時后收集培養(yǎng)基，W500Xg離屯、10分鐘去除細胞碎化可獲得含慢病 毒的培養(yǎng)基。離屯、后，W0. 45μm的低蛋白結合陽S過濾膜過濾該培養(yǎng)基。
[0057] (2-5)使用巧光顯微鏡對慢病毒感染H1299工具細胞進行滴度檢驗。
[0058] 得到目的基因慢病毒LP-S0406-LV201-400。
[0059]圖2所示為eGFP陽性對照質粒載體（無0RF序列），同法用于eGFP陽性對照質粒 載體的病毒包裝，得到對照慢病毒LP-NEG-LV201-100。
[0060] (3)轉染和篩選
[0061] (3-1)藥物最小致死濃度測定
[0062] 采用正常的人骨肉瘤細胞U-20S(購自中國科學院上海細胞庫）篩選出該細胞嚷 嶺霉素的最小致死濃度為2μg/mU按最小致死濃度進行穩(wěn)轉株的藥物篩選。
[0063] (3-2)病毒感染
[0064] 將U-20S細胞計數(shù)后鋪到6孔板中培養(yǎng)，各孔加入2血1640培養(yǎng)基（添加5% FBS+10%馬血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液），在5%C〇2條件下，37°C培養(yǎng)2地；鋪板24h 后每孔加入目的基因慢病毒LP-S0406-LV201-40050μ1，培養(yǎng)4她；同法用于對照慢病毒 LP-NEG-LV201-100侵染細胞；感染4化后，觀察慢病毒侵染結果，拍攝細胞巧光圖片，如圖 3、圖4所示，慢病毒浸染后，巧光細胞數(shù)量約為80%左右，說明病毒包裝成功。
[0065] (3-3)藥篩
[0066] 用膜酶消化感染過的細胞并轉移至6孔板（每塊6孔板對應一種慢病毒，留出一 孔用于陰性對照細胞），W含2μg/ml嚷嶺霉素的1640培養(yǎng)基（添加5%FBS+10%馬血清、 青霉素-鏈霉素雙抗溶液）進行藥篩培養(yǎng)；連續(xù)加藥培養(yǎng)12天（嚷嶺霉素濃度2μg/ml)， 待細胞長滿后，得到穩(wěn)定過表達CADMl的骨肉瘤U-2os細胞（命名為"骨肉瘤U-20S-CADM1 細胞株"，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號為：CCTCCNO:C201518)、W及eGFP陽 性對照質粒病毒感染的空載體U-20S細胞（命名為對照病毒U-20S細胞株）。收取樣品進 行后續(xù)檢測。
[0067] 二、過表達CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細胞株的檢測
[006引 （一）Rea^TimePCR檢測目的基因CAMD1的表達情況
[0069] 1、連輪巧驟
[0070] 1-URNA抽提
[0071] 1)樣本處理
[007引先離屯、收集細胞，約5~10X106細胞數(shù)加ImLTRIzol反復吹打裂解細胞。
[007引。相分離
[0074]每1血TRIzol中加入200μ1氯仿，蓋上蓋子，振蕩混勻約15s，室溫靜置2~ 5min，然后12000g冷凍離屯、15min，小屯、取出樣品，通過觀察可W發(fā)現(xiàn)樣品分Ξ層，其中最 上層含有RNA樣品。
[00巧]3)RNA沉淀
[0076] 小屯、吸取上清液約450μ1 (每1血TRIzol的吸取量）至含有600μ1冷凍異丙醇 的新離屯、管中，上下顛倒混勻，-20°C靜置至少30min，12000g冷凍離屯、lOmin。
[0077] 4)RNA洗涂
[0078] 去上清液，加入500μ1冷凍的75%乙醇，混勻后12000g冷凍離屯、5min，去上清 液，再稍微離屯、，吸去上清液。
[0079] 5)RNA溶解
[0080] 余下沉淀自然風干約5~lOmin(注意不能風太干，只需要沉淀泛白即可），加入 50μ1DEPC水溶解沉淀。貼上標簽后-80°C保存。
[0081]RNA抽提結果如表1所示。
[00的]表1RNA抽提結果
[0083]
[0084] 1-2、反轉錄反應
[0085] 1)解凍First StrandcDNASynthesis Kit的試劑，混勻，冰上靜置。
[0086] 2)按照表2所示冰上配置RNA反轉錄反應液。
[0087] 表2RNA反轉錄反應液
[0088]
[0089] 3)RNA變性
[0090] 按照表3反應體系進行混勻反應Mix, 65°C滅活處理lOmin。
[00川表3RNA變性反應體系
[0092]
[0093] 進行短暫離屯、后37°C解育lh，85°C滅活處理5min，: 5(滅菌水）稀釋，-20°C 保存。
[0094] 1-3、定量？0?實驗
[009引PCR反應體系如表4所示。
[009引表4PCR反應體系
[0097]
[0098] PCR反應，采用了表5所示的標準的Ξ步法程序進行反應。
[009引表5PCR反應程序
[0100]
[0101] 在PCR反應后，采用表6所示的程序進行烙解曲線分析。
[0102] 表6烙解曲線分析程序
[0103]
[0104] 內參基因GAPDH及目的基因CADM1的擴增溶解曲線見圖5、圖6、圖7、圖8。 ?！?、連輪結果
[0106] 根據(jù)上述Real-TimePCR檢測進行分析得出表7。
[0107] 表7SIVA1表達量分析結果 [010引
[0109] 從表7可W看出，骨肉瘤U-20S-CADM1細胞株中SIVA1的表達量為對照病毒U-20S 細胞株的18. 22倍。
[0110](二）Western blot檢測目的基因CAMD1的表達情況 ?！璢 1、連輪巧驟
[0112] 1-1、蛋白樣品的準備
[0113] 提取細胞蛋白后，按比例加入4Xloadingbuffer,95°C加熱5min。選擇10%的 SDS-PAGE膠進行電泳。電壓條件：濃縮膠80V30min，分離膠120V90min。
[0114] 1-2、轉膜
[0115] 剪出大小合適的PVDF膜和濾紙，PVDF膜提前15min用甲醇浸泡，然后用電轉移 Buffer與濾紙一起浸泡，按墊片、濾紙、濾紙、膠、膜、濾紙、濾紙、墊片的順序進行擺放，半干 轉 21￥，轉膜45111111。
[0116] 1-3、封閉
[0117] 用8ml5%脫脂奶粉溶液（用TTBS配制）進行封閉，放置搖床上室溫封閉化。
[011引 1-4、洗涂
[0119]用 5mlTTBS洗 3 次，每次 5min。
[0120] 1-5、一抗解育
[0121]用5% 的脫脂奶（含0. 05% 的Tween-20)按 1 :200 配制Rabbitpolyclonal anti-CAMDlantibody一抗 4血，用5%的脫脂奶（含0. 05%的Tween-20)按 1 :2000稀釋 配制GAPDH抗體4血，4度反應過夜，重復步驟1-4。
[0122] 1-6、二抗的解育
[0123] 用5 %的脫脂奶（含0. 05 %的Tween-20)按1 :3000稀釋HRP標記的Goat anti-r油bitIgGantibody酶標二抗，用 5mlTTBS洗 4-6 次，每次 5min。
[0124] 1-7、E化顯色
[012引將配制好的E化顯色也加入膜上，反應5min后，曝光。內參GAPDH及目的基因CADM1的表達情況見圖9。
[012引 2、連輪結果
[0127]運用圖像分析軟件ImageJ對Westernblot結果進行灰度分析，分析結果如表8所示。
[012引表8Westernblot結果進行灰度分析
[0129]
[0130] 結果表明，骨肉瘤U-20S-CADM1細胞株中CADM1的表達量相對于對照病毒U-20S 細胞株增加了 20. 79倍。
[0131]Ξ、過表達CADM1的骨肉瘤U-20S-CADM1細胞株的功能檢測
[0132] 1、抑制骨肉瘤細胞U-20S的增殖能力
[0133]在25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)人骨肉瘤細胞扣-2os)(空白組）、對照病毒U-20S細胞株 (空載體組）及骨肉瘤U-20S-CADM1細胞株（轉染組）Ξ種細胞，收集對數(shù)生長期