俄羅斯野山參的多重pcr鑒定方法及其專(zhuān)用引物與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本1發(fā)明屬于野山參及其制品的分子生物學(xué)鑒定方法，特別是設(shè)及一種利用DNA 分子標(biāo)記對(duì)俄羅斯野山參和國(guó)內(nèi)人參進(jìn)行區(qū)分和鑒定的方法及其專(zhuān)用引物與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參是五加科植物人參（PanaxginsengC.A.Meyer)的干燥根及根莖。根據(jù)人參 的生長(zhǎng)方式不同可W分為野山參、林下參、園參等。由于市場(chǎng)的廣泛需求及野山參的溯臨滅 絕，目前林下參和園參是市場(chǎng)上人參藥材的主要來(lái)源。傳統(tǒng)野生人參有兩大主產(chǎn)區(qū)，一個(gè)是 現(xiàn)在的吉林通化縣為中屯、地域的長(zhǎng)白山區(qū)，另一個(gè)是烏蘇里江W東的錫赫特山區(qū)。但是，道 光二十年（1840)鴉片戰(zhàn)爭(zhēng)W后，通過(guò)《中俄環(huán)渾條約》與《中俄北京條約》將烏蘇里江W東 約四十萬(wàn)平方公里的中國(guó)領(lǐng)上強(qiáng)行劃歸俄國(guó)。從此，使中國(guó)的人參主產(chǎn)區(qū)之一烏蘇里江W 東的錫赫特山區(qū)喪失殆盡。
[000引 目前，我國(guó)長(zhǎng)白山區(qū)的野生人參已溯臨滅絕，非常稀少，民間貿(mào)易也非常稀少。而 產(chǎn)于俄羅斯錫赫特山區(qū)的野生人參由于受到較好的保護(hù)，產(chǎn)量比較客觀(guān)，在民間形成較大 的貿(mào)易量。但是，由于俄羅斯野山參價(jià)格昂貴，導(dǎo)致市場(chǎng)上出現(xiàn)用其它人參冒充俄羅斯野山 參的情況，因此，市場(chǎng)上需要對(duì)是否為俄羅斯野山參進(jìn)行鑒別。傳統(tǒng)的野山參與林下參或園 參的鑒別主要采用表型性狀法，但運(yùn)種方法會(huì)受到環(huán)境、人參生長(zhǎng)發(fā)育階段、人為主觀(guān)因素 等影響，尤其是多數(shù)人參制品為初加工或深加工后產(chǎn)品，失去了原來(lái)的性狀，因此表型性狀 法有很大的局限性。俄羅斯野山參的化學(xué)鑒定法主要W皂巧分析為主，但化學(xué)法需要的前 處理過(guò)程復(fù)雜，而且部分野山參制品受到人參加工過(guò)程的影響，皂巧的含量非常低，會(huì)妨礙 俄羅斯野山參的鑒定。因此，需要一種更為有效和準(zhǔn)確鑒定俄羅斯野山參及其制品的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明利用發(fā)現(xiàn)的俄羅斯野山參的單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)（SN巧設(shè)計(jì)了俄羅斯野 山參的特異性引物，并利用多重PCR建立了俄羅斯野山參（Russianwildginseng)區(qū)別于 其他人參（如中國(guó)人參化ineseginseng)的鑒定方法。
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的專(zhuān)用引物。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的專(zhuān)用引物，包括俄羅斯野山參 的特異性引物nad7wR(序列表中SEQIDNo:3)。也可W包括人參線(xiàn)粒體氧化還原脫氨酶 nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子（intron3)的通用側(cè)翼引物nad73F(序列表中SEQIDNo:1)和 nad73R(序列表中沈QIDNo:2)。
[0007] 俄羅斯野山參線(xiàn)粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子序列如序列表中 SEQIDNo:4所示（中國(guó)人參線(xiàn)粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子序列如序 列表中SEQIDNo:5所示）。
[0008] 俄羅斯野山參的特異性引物nad7wR(序列表中SEQIDNo:3)是根據(jù)俄羅斯野山 參線(xiàn)粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子中的單核巧酸多態(tài)性（SN巧位點(diǎn)（序 列表中SEQIDNo:4)設(shè)計(jì)的，自5'端第700位堿基俄羅斯野山參為G(中國(guó)人參為Τ)。
[0009] 上述俄羅斯野山參特異性引物nad7wR引物序列的衍生序列也屬于本發(fā)明。所述 衍生序列是指在本發(fā)明引物的基礎(chǔ)上，在序列的5'端和/或3'端再添加、減少一個(gè)或多個(gè) 堿基得到的序列。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法。
[0011] 本發(fā)明所提供的俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法，是用上述引物對(duì)待測(cè)人參的 基因組DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后對(duì)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 俄羅斯野山參可W出現(xiàn)由通用引物nad73F和nad73R擴(kuò)增出的99化P的DNA條帶W及由特 異性引物nad7wR擴(kuò)增出的72化P的特異性條帶（中國(guó)人參僅出現(xiàn)由通用引物nad73F和 nad73R擴(kuò)增出的992bp的DNA條帶）。
[001引所述20μΙ多重PCR反應(yīng)體系為：lyL(lOng)人參基因組DNA，0. 1化(0. 05μΜ) 引物nad7wR，2μL(1μΜ)引物nad73F，2μL(1μΜ)引物nad73R，4. 9μL滅菌超純水，10μL 2XPremixDNApolymerase(配方：2μΙlOXEasyTaqbuffer'I.GOyL2.5mMdNTPs， 0. 4μLEas}fTaqDNApolymerase, 6μL&0)。
[0013] 多重PCR反應(yīng)條件為：先 94°C預(yù)變性 4min;然后 94°C30s，54°C30s，72°C30s，共 33個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保溫。
[0014] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供一種俄羅斯野山參的多重PCR鑒定試劑盒。
[0015] 本發(fā)明所提供的俄羅斯野山參的多重PCR鑒定試劑盒，包括上述人參線(xiàn)粒體氧化 還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子的通用側(cè)翼引物nad73F和nad73R及俄羅斯野山參 的特異性引物nad7wR。
[0016] 本發(fā)明提供了俄羅斯野山參的多重PCR鑒定技術(shù)，從而可達(dá)到準(zhǔn)確鑒定俄羅斯野 山參的目的。本發(fā)明可W解決人參市場(chǎng)上俄羅斯野山參商品的鑒別和商品價(jià)值的評(píng)價(jià)問(wèn) 題，為俄羅斯野山參的鑒別提供了客觀(guān)標(biāo)準(zhǔn)，將對(duì)規(guī)范人參市場(chǎng)和保證人參產(chǎn)業(yè)的良性發(fā) 展發(fā)揮重要作用。
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1為俄羅斯野山參與普通人參的nad7基因中第Ξ個(gè)內(nèi)含子的核巧酸序列比對(duì) 結(jié)果；
[0019] 圖2為俄羅斯野山參與普通人參的多重PCR鑒定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明是基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了俄羅斯野山參的單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)（SN巧而做出。
[0021]單核巧酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymo;rphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只設(shè)及到單個(gè)堿 基的變異，運(yùn)種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換（transition)或顛換（transversion)所引起，也 可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說(shuō)的SNP并不包括后兩種情況。運(yùn)種變異可能是轉(zhuǎn) 換（C一T，在其互補(bǔ)鏈上則為G-A)，也可能是顛換（C一A，G-T，C一G，A-T)。轉(zhuǎn)換 的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3,其它幾種變異的發(fā) 生幾率相似。
[0022]SNP檢測(cè)方法常采用一些已有的成熟技術(shù)，如DM測(cè)序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)、 限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)、等位基因特異的寡聚核巧酸雜交（AS0)等，也采用根 據(jù)DNA列陣的微測(cè)序法、動(dòng)態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核巧酸特異的連接、DNA忍片W及 化qMan系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行祀序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測(cè)。
[0023] 本發(fā)明W下述實(shí)施例詳細(xì)介紹利用俄羅斯野山參的單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)實(shí)施SNP 檢測(cè)技術(shù)對(duì)俄羅斯野山參的鑒別。
[0024] 實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)：《Molecular Cloning:ALaboratoryManual》 （Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:A LaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。
[00巧]實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑W達(dá) 到具體公開(kāi)的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的 來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可W按照實(shí)施例中的提 示替換使用。
[0026] 所有引物合成及序列測(cè)定工作均由北京全式金生物技術(shù)有限公司完成。
[0027] 實(shí)施例在W本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的 操作過(guò)程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0028] 實(shí)施例1、俄羅斯野山參多重PCR鑒定
[0029] 一、設(shè)計(jì)用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的專(zhuān)用引物
[0030] 根據(jù)Genbank中的俄羅斯野山參線(xiàn)粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含 子（intron3)序列（冊(cè)241271)及其突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的專(zhuān)用 引物。
[0031] 1、設(shè)計(jì)人參通用的內(nèi)含子側(cè)翼引物
[0032] 利用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremie巧設(shè)計(jì)俄羅斯野山參和對(duì)照人參（中國(guó)人參） 線(xiàn)粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子側(cè)翼引物，分別為
[0033] nad73F:巧，-CAACAACGGTTCTGCCTGAC-3，，序列表中沈QIDNo:1)和
[0034] nad73R:(5, -GCCCACCACTTAACTTTCAC-3,，序列表中沈QIDNo:2)。
[0035] 2、俄羅斯野山參和對(duì)照人參線(xiàn)粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子 (intro