nS)序列比對
[003引 2. 1提取人參基因組DNA
[0037] 取適量冷藏的俄羅斯野山參（采自于俄羅斯遠(yuǎn)東的錫赫特山區(qū)）和對照人參（采 自于吉林省長白縣）的根，液氮研磨至粉末狀后，用植物基因組DNA提取試劑盒（購自北京 全式金生物技術(shù)有限公司）提取人參根的基因組DNA。
[0038] 2. 2PCR擴(kuò)增俄羅斯野山參和對照人參線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè) 內(nèi)含子序列
[0039] 20μΙPCR反應(yīng)體系為：lyL(lOng)人參根的基因組0ΝΑ，2μΙ(1μΜ)引物 nad73F，2yL(lyM)引物nad73R，5yL滅菌超純水，ΙΟμΙ2XEasyTaqSupermixDNA polymerase(配方：配方：2μL10XEasyTaqbuffe;r，1.60yL2. 5mMdNTPs，0.4μL EasyTaqDNApolymerase, 6μL&0)。
[0040] PCR反應(yīng)條件為：先 94°C預(yù)變性 4min;然后 94°C30s，60°C30s，72°CImin，共 36 個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸7min，4°C保溫結(jié)束反應(yīng)。
[0041] 2. 3序列比對
[004引對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，利用SeqMan軟件對DNA測序結(jié)果進(jìn)行拼接，并用BioEdit軟件進(jìn)行校正，確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為99化P。利用ClustalW2在線軟件對俄羅 斯野山參和對照人參線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子序列進(jìn)行比對。比 對結(jié)果如圖1所示，俄羅斯野山參線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第Ξ個(gè)內(nèi)含子序列如 序列表中SEQIDNo:4所示，對照人參（中國人參）線粒體氧化還原脫氨酶nad7基因的第 Ξ個(gè)內(nèi)含子序列如序列表中SEQIDNo:5所示，比對可知在自5'端第700bp處（SNP位點(diǎn)） 俄羅斯野山參為G，對照人參為T。
[0043]3、設(shè)計(jì)俄羅斯野山參的特異引物
[0044] 根據(jù)序列比對中發(fā)現(xiàn)的俄羅斯野山參的SNP位點(diǎn)，在第700-72化P處設(shè)計(jì)俄羅斯 野山參的特異性引物nad7wR，結(jié)果序列為巧'-GGCTTTCTTTGCCTTATTATTC-3'，序列表中沈Q IDNo:3)。該序列中，為了保證引物對俄羅斯野山參的絕對特異性，在引物的倒數(shù)第Ξ位堿 基中將G改為T(序列表中SEQIDNo:3)，使得引物nad7wR對非目標(biāo)DNA有兩個(gè)堿基的錯(cuò) 配。
[0045] 二、俄羅斯野山參和對照人參的多重PCR鑒定
[0046] W俄羅斯野山參和對照人參不同品種的基因組DNA為模板，利用俄羅斯野山參的 特異性引物nad7wR及內(nèi)含子側(cè)翼引物nad73F和nad73R進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。
[0047] 俄羅斯野山參采自于俄羅斯遠(yuǎn)東的錫赫特山區(qū)。對照人參有：大馬牙（采自于吉 林省長白縣），二馬牙（采自于吉林省長白縣），黃果（采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所）， 林下山參（采自于迂寧桓仁）。
[004引 20μL多重PCR反應(yīng)體系為：lμLα0ng)人參基因組DNA，0.1μU0.05μM)弓| 物nad7wR，2μL(1μM)引物nad73F，2μL(1μM)引物nad73R，4. 9μL滅菌超純水，10μL2XPremixDNApolymerase(配方：2μΙlOXEasyTaqbuffe;r，1.60yL2.5mMdNTPs， 0. 4μLEas5rTaqDNApolymerase, 6μL&0)。PCR的反應(yīng)條件為：先 94°C預(yù)變性 4min;然 后94°C30s，54°C30s，72°C30s，共33個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保溫結(jié)束反應(yīng)。
[0049] 取3μL多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2 (泳道1-5 俄羅斯野山參，泳道6-7大馬牙，泳道8-9二馬牙，泳道10-11邊條，泳道12-14黃果，泳 道15-16林下山參）所示，所有人參品種均出現(xiàn)了由通用引物nad73F和nad73R擴(kuò)增出的 992bp的DNA條帶，但只有俄羅斯野山參產(chǎn)生了由nad7wR擴(kuò)增出的72化P特異性條帶。
[0050] 切膠回收俄羅斯野山參的特異性條帶，經(jīng)克隆測序得到俄羅斯野山參的特異性條 帶的長度為72化P，其核巧酸序列如序列表中SEQIDNo:6所示。由此可W看出，利用本發(fā) 明的引物及多重PCR技術(shù)可W實(shí)現(xiàn)對俄羅斯野山參的特異性區(qū)分和鑒定。
[0051] 實(shí)施例2、俄羅斯野山參多重PCR鑒定試劑盒
[005引 將引物0. 05μΜ的引物nad7wR、1μΜ的引物nad73F和1μΜ的引物nad73R共同 包裝，得到用于20μL反應(yīng)體系的俄羅斯野山參多重PCR鑒定試劑盒。
[0053] 為方便使用，試劑盒中還可W按W下反應(yīng)體系配制其它試劑：例如20μL多重 PCR反應(yīng)體系為：lyL(lOng)人參基因組DNA，0.lyL(0. 05μΜ)引物nad7wR，2yL(lyM) 引物nad73F，2yL(lyM)引物nad73R，4. 9μΙ滅菌超純水，ΙΟμΙ2XPremixDM polymerase(配方：2μΙlOXEasyTaqbuffer'I.GOyL2.5mMdNTPs，0.4yLEas}fTaq DMpolymerase, 6μL&0)。
[0054] 試劑盒的使用可參照實(shí)施例1之二的PCR的反應(yīng)條件：先94°C預(yù)變性4min;然后 94°C30s，54°C30s，72°C30s，共33個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保溫結(jié)束反應(yīng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 俄羅斯野山參多重PCR鑒定的特異性引物，是根據(jù)俄羅斯野山參線粒體氧化還原脫 氫酶nad7基因的第三個(gè)內(nèi)含子中的單核苷酸多態(tài)性（SNP)位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，自5'端第700位 堿基俄羅斯野山參為G。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的俄羅斯野山參多重PCR鑒定的特異性引物，其特征在于：所 述俄羅斯野山參線粒體氧化還原脫氫酶nad7基因的第三個(gè)內(nèi)含子序列如序列表中SEQID No:4所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的俄羅斯野山參多重PCR鑒定的特異性引物，其特征在于： 該特異性引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDN〇:3所示，命名為nad7wR。4. 用于俄羅斯野山參多重PCR鑒定的引物組合，其特征在于：包括權(quán)利要求1或2或 3所述的俄羅斯野山參多重PCR鑒定的特異性引物，還包括人參線粒體氧化還原脫氫酶 nad7基因的第三個(gè)內(nèi)含子（intron3)的通用側(cè)翼引物nad73F(序列表中SEQIDNo:1)和 nad73R(序列表中SEQIDNo:2)。5. -種俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法，是用權(quán)利要求1-3任一所述特異性引物或 權(quán)利要求4所述引物組合對待測人參的基因組DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后對多重PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)由特異性引物nad7wR擴(kuò)增出721bp的特異 性條帶，則判定為含有俄羅斯野山參。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法，其特征在于：鑒別中還 包括是否出現(xiàn)由通用引物nad73F和nad73R擴(kuò)增出的992bp的DNA條帶，如僅出現(xiàn)該條帶 則不是俄羅斯野山參。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法，其特征在于：所述 20yL多重PCR反應(yīng)體系為：lyL(lOng)人參基因組DNA，0. 1μL(0·05μΜ)引物nad7wR， 2μL(1μΜ)引物nad73F，2yL(lyM)引物nad73R，4.9yL滅菌超純水，10yL2XPremix DNApolymerase(配方：2yLlOXEasyTaqbufTer，1.60yL2.5mMdNTPs，0.4yLEasyTaq DNApolymerase, 6μLH20) 〇8. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法，其特征在于：所述多 重PCR反應(yīng)條件為：先94°C預(yù)變性4min;然后94°C30s，54°C30s，72°C30s，共33個(gè)循環(huán)； 最后72°C延伸5min，4°C保溫。9. 一種俄羅斯野山參的多重PCR鑒定試劑盒，包括權(quán)利要求1-3任一所述俄羅斯野山 參的特異性引物nad7wR。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述俄羅斯野山參的多重PCR鑒定試劑盒，其特征在于，還包括人 參線粒體氧化還原脫氫酶nad7基因的第三個(gè)內(nèi)含子的通用側(cè)翼引物nad73F(序列表中SEQ IDNo:1)和nad73R(序列表中SEQ IDNo:2)〇
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種俄羅斯野山參的多重PCR鑒定方法，是利用發(fā)現(xiàn)的俄羅斯野山參的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)設(shè)計(jì)了俄羅斯野山參的特異性引物，并利用多重PCR建立了俄羅斯野山參區(qū)別于其它人參的鑒定方法，從而可準(zhǔn)確鑒定俄羅斯野山參。本發(fā)明可以解決人參市場上俄羅斯野山參及其商品的鑒別和商品價(jià)值的評價(jià)問題，為俄羅斯野山參的鑒別提供了客觀標(biāo)準(zhǔn)，將對規(guī)范人參市場和保證人參產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展發(fā)揮作用。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105368937
【申請?zhí)枴緾N201510746372
【發(fā)明人】李桂生, 王洪濤, 解飛霞, 崔曉偉, 潘麗麗, 初紅梅
【申請人】吉林長白綠葉人參產(chǎn)業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月5日