一種用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標(biāo)記檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要通過(guò)測(cè)序或者飛行質(zhì)譜等方法對(duì)CXCR1基因編碼區(qū)SNP突變點(diǎn)進(jìn)行檢 巧。，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛生產(chǎn)壽命是指奶牛從第1次產(chǎn)轄到死亡或者淘汰之間的時(shí)間，它能夠反映奶 牛避免被淘汰的能力。奶牛的生產(chǎn)壽命是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，它在增加牧場(chǎng)主的收入和 育種方面有重要的作用。有研究表明（WolfovaΜetal，2007)，奶牛的產(chǎn)奶胎次從第3胎 提高到第4胎，其效益將增加11%~13%。另外，生產(chǎn)壽命的增加有利于減少淘汰奶牛W 及購(gòu)買其他奶牛的所產(chǎn)生的費(fèi)用。
[0003] 然而，隨著對(duì)全球?qū)δ膛．a(chǎn)奶量等數(shù)量性狀的高度選擇，奶牛乳房炎、繁殖病癥、 營(yíng)養(yǎng)代謝病等疾病逐漸增加，其生產(chǎn)壽命呈下降趨勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)牛場(chǎng)淘汰奶牛的平 均胎次約為2. 8胎（約為5. 5歲）。運(yùn)種情況說(shuō)明了每頭奶?？們r(jià)值的下降，同時(shí)也導(dǎo)致了 淘汰奶牛W及購(gòu)買其他奶牛的費(fèi)用的增加，給牧場(chǎng)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，急需一種 能預(yù)測(cè)和提高奶牛生產(chǎn)壽命的分子標(biāo)記，W便于結(jié)合其信息，對(duì)奶牛進(jìn)行W增長(zhǎng)后代奶牛 生產(chǎn)壽命為目的的選擇，并結(jié)合傳統(tǒng)的奶牛育種、人工授精等技術(shù)，提高奶牛的有效生產(chǎn)壽 命，從而提高奶牛的終生產(chǎn)值和牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004] 近年來(lái)，國(guó)外圍繞影響奶牛生產(chǎn)壽命的分子標(biāo)記進(jìn)行了部分研究，發(fā)現(xiàn)了部分有 價(jià)值的結(jié)果。Ashwell等（1997,1999)分別在奶牛第2、12、16、21、23號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了 與其生產(chǎn)壽命相關(guān)的微衛(wèi)星；Heyen等（1999)在BTA21上發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度為85cM的微衛(wèi)星 ILSTS054;Khatib等（2005,2007)、Komisarek等（2009)、John等（2011)又發(fā)現(xiàn)了ABCG2、 PPARGC1A、化R1和SCD1與生產(chǎn)壽命有一定程度的相關(guān)性。然而，微衛(wèi)星主要位于基因非編 碼區(qū)，不是真正意義上的功能基因；而ABCG2、PPARGC1A、化R1和SCD1等基因本身與免疫、 疾病等具體性狀并無(wú)密切關(guān)系，很難從生物學(xué)過(guò)程上進(jìn)行解釋，從而大大地降低了其可信 度，因此到目前為止尚未被運(yùn)用。因此，急需一種與奶牛生產(chǎn)性能、免疫和疾病等性狀密切 相關(guān)，同時(shí)能用于奶牛生產(chǎn)壽命選擇的新的分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法。 陽(yáng)0化]本發(fā)明專利所利用的分子標(biāo)記CXCR1基因?qū)儆诿庖呋蚣易逯弧２糠盅芯勘?明（VerbekeJ，etal，2014,2015;BeecherCetal，2010)，CXCRl基因與奶牛泌乳性能、 免疫力、乳房炎、產(chǎn)科疾病等疾病有一定程度的關(guān)聯(lián)，但尚未見其與?？萍倚笊a(chǎn)壽命的相 關(guān)報(bào)道。由于奶牛生產(chǎn)中，其泌乳性能、免疫力、乳房炎、產(chǎn)科疾病性狀與奶牛生產(chǎn)壽命密切 相關(guān)，低免疫力和生產(chǎn)性能和較高的疾病發(fā)生率會(huì)導(dǎo)致奶牛提前淘汰或死亡，從而降低其 生產(chǎn)壽命，我們推測(cè)該基因與奶牛生產(chǎn)壽命也應(yīng)有一定程度的關(guān)聯(lián)。為此，我們根據(jù)研究需 要，對(duì)奶牛大樣本群體CXCR1基因編碼區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)合其疾病及淘汰等信息，最終發(fā)現(xiàn) 了一個(gè)與生產(chǎn)壽命有顯著相關(guān)的SNP突變。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的目的是確定一種與奶牛生產(chǎn)性能、免疫和疾病等性狀密切相關(guān)，同時(shí)能 夠被應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的檢測(cè)方法，W提高奶牛后代的生產(chǎn)壽命和終生生產(chǎn)效 益。
[0019] 為了實(shí)現(xiàn)^上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0020] 本發(fā)明提供了一種用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，其特征在 于，包括W下步驟： 陽(yáng)02U 1)從樣品中提取DM;
[0022] 2)W提取的DM為樣本，使用用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標(biāo)記引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；
[0023] 3)檢測(cè)步驟2)中的PCR產(chǎn)物的序列，根據(jù)分子標(biāo)記，即：CXCR1基因第816位點(diǎn)的 SNP突變，判定其樣品的基因型為AA，AC或者CC型，對(duì)奶牛生產(chǎn)壽命進(jìn)行輔助選擇。
[0024] 可選地，步驟3)中的檢測(cè)方法可W是普通測(cè)序法，此時(shí)步驟2)中使用的用于奶牛 生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標(biāo)記引物的核巧酸序列為： 陽(yáng)0巧]上游引物為：5，-ATGACAATCATCCTGAAAGA-3，；
[0026]下游引物為：5 '-TCAGAGGGTAGTAGACGTGT-3'。
[0027] 可選地，步驟3)中的檢測(cè)方法也可W是SNP突變采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法。此時(shí)使用 的用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標(biāo)記引物的核巧酸序列為：
[0028]cxcrl-816-F 5' -ACGTTGGATGTCATCTTTGCTGTCGTGCTC-3'
[0029]cxcrl-816-R 5， -ACGTTGGATGAGGTCTCAGCAATCACATGG-3'
[0030]cxcrl-816-U 5' -CTACAACCTGGTCCTGAT-3'
[0031] 此外，本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法中步驟3)中所使用的分子標(biāo)記，即：在所述CXCR1 基因的核巧酸序列第816位有一個(gè)堿基突變（A/C)的等位基因的SNP標(biāo)記，也可W應(yīng)用于 其他與奶牛生產(chǎn)壽命相關(guān)的判定或者檢測(cè)中。
[0032] 本發(fā)明達(dá)到了如下的有益效果：
[0033]1)本發(fā)明首次披露了CXCR1-816的SNP突變位點(diǎn)的基因型在對(duì)奶牛生產(chǎn)壽命進(jìn)行 輔助選擇方面的應(yīng)用。相比于現(xiàn)有技術(shù)中圍繞奶牛生產(chǎn)壽命進(jìn)行的分子標(biāo)記，本發(fā)明設(shè)計(jì) 標(biāo)記引物時(shí)使用的CXCR1基因與奶牛生產(chǎn)性能、免疫和疾病等性狀密切相關(guān)，其CXCR1-816 的SNP突變標(biāo)記點(diǎn)與奶牛生產(chǎn)壽命顯著相關(guān)，因而具有更高的準(zhǔn)確性和可信度。
[0034] 2)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單靈活、檢測(cè)準(zhǔn)確率高、效率高，且節(jié)約成本。針 對(duì)于CXCR1-816位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)，可W使用普通測(cè)序方法，也可W采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法。 相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序而言，后者對(duì)于大樣本巧00個(gè)DNA樣本W(wǎng)上）檢測(cè)更具有優(yōu)勢(shì)，最低成本 可達(dá)5元/個(gè)體，而傳統(tǒng)PCR測(cè)序成本至少在6倍W上（即30元/個(gè)體）。另外，由于采用 飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)是自動(dòng)化檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間也大大縮短，500-1000個(gè)DNA樣品，最快可在 2-3天內(nèi)