完成。對于相同樣本量，使用傳統(tǒng)PCR測序方法鑒定至少在10天W上。
[0035] 3)使用本發(fā)明的分子標記檢測方法可W有效地針對奶牛生產(chǎn)壽命對種牛進行輔 助選擇，W提高后代奶牛的生產(chǎn)壽命，從而減少因淘汰奶牛而購買其他奶牛的所產(chǎn)生的費 用，間接地提高產(chǎn)值。
【附圖說明】
[0036]圖 1 是CXCR1-816 測序圖。
[0037] 圖2是CXCR1-816位點不同基因型質(zhì)譜分型圖。 陽03引圖3是CXCR1-816位點不同基因型1-5胎內(nèi)的累積生存概率。
【具體實施方式】
[0039] 為了闡明本發(fā)明的技術方案及技術目的，下面結合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明 做進一步的介紹。 陽040]實施例1:
[0041] 本實施例中，對CXCR1-816位點的SNP突變進行普通測序。
[0042] 本實施例1中提供的對奶牛生產(chǎn)壽命進行輔助選擇的分子標記檢測方法主要包 括如下步驟：
[0043] (1)樣品采集：使用常規(guī)方法從lOmL奶牛尾靜脈抗凝血中提取DNA; W44] 似引物設計：根據(jù)CXCR1基因編碼區(qū)序列，使用原始序列用軟件（Primer5. 0) 設計引物，該引物的核巧酸序列如下：
[0045] F：ATGACAATCATCCTGAAAGA
[0046] R：TCAGAGGGTAGTAGACGTGT
[0047] (3)PCR擴增體系及PCR擴增程序：使用步驟似中設計的引物，W步驟（1)中所 獲得的總DNA為模板，進行PCR擴增：
[0048] 30μΙ的反應體系中含有aOXPCR Buffer 3yL，dNTP mix(10mM)0. 5yL，rTaq 0. 5 μ L，10 μ M化抓日'(1 Primer 0. 5 μ L，10 μ M Reverse Primer 0. 5 μ L，DNA樣品1 μ L， Water(nuclease-free)24 μ L。 W例 PCR擴增的反應條件為：預變性94°C5分鐘，再經(jīng)94°C變性30秒，55°C復性30秒， 72 °C延伸30秒，35循環(huán)，最后72 °C延伸10分鐘。
[0050] (4)反應結束后，將所獲得的PCR產(chǎn)物直接用ABI 9700型測序儀進行測序。對測 序所得結果，用DNAMAN軟件與參考序列（登錄號：NM_001105038. 1))進行比對，并判定其 突變位點。隨后，用化romas軟件打開測序圖，根據(jù)CXCR1基因外顯子第816位堿基序列， 對照該位置堿基和圖形，即可判定CXCR1-816的基因型（見圖1)。圖中箭頭指示處即為 CXCR1-816突變位點，其中雙峰為雜合子基因型。 陽0川實施例2:
[0052] 本實施例中，對CXCR1-816位點的SNP突變采用飛行時間質(zhì)譜法進行檢測。此方 法更適用于檢測大批量樣本（如，樣本數(shù)大于500)，高效且價格便宜。
[0053] 本實施例2中提供的對奶牛生產(chǎn)壽命進行輔助選擇的分子標記檢測方法主要包 括如下步驟：
[0054] (1)樣品采集：使用常規(guī)方法從lOmL奶牛尾靜脈抗凝血中提取DNA; 陽化引 似引物設計：根據(jù)CXCR1基因編碼區(qū)序列，PCR引物和單堿基延伸引物用Assay Designer (Sequenom)軟件包設計如下： 陽化6] cxcrl-816-F 5' -ACGTTGGATGTCATCTTTGCTGTCGTGCTC-3'
[0057] cxcrl-816-R 5，-ACGTTGGATGAGGTCTCAGCAATCACATGG-3'
[0058] cxcrl-816-U 5' -CTACAACCTGGTCCTGAT-3，
[0059] (3) PCR擴增體系及PCR擴增程序： W60] 其中，所有需要分型的DNA樣本都稀釋到5ng/yl，取1μ1DNA樣本，將其與 0. 95μ1 水、0. 625μ1PCR緩沖液（含 15mMMgCy、1μ1 2. 5mMdNTP、0. 325μ1 的 25mM MgClz、1μ1PCR引物W及 0. 1μ1HotStarTaq酶（Qiagen)混合在一起。PCR擴增的反應 條件為：94°C15分鐘；94°C20秒，56°C30秒，72°C1分鐘，共45個循環(huán)；最終72°C3分 鐘。
[006U(4)采用飛行質(zhì)譜方法檢測步驟（3)中所獲得的PCR產(chǎn)物：
[0062] 所述SNP分型利用美國Sequenom公司的MassARRAY系統(tǒng)完成，該系統(tǒng)是基于基質(zhì) 輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術（MALDI-T0F)。飛行時間質(zhì)譜法檢測方法如下： 陽06引 PCR擴增后，剩余的dNTP將被去憐酸消化掉，反應體系包括1. 53μ1水、0. 17μ1 SAP緩沖液、0. 3單位堿性憐酸酶（Sequenom)。該反應在37°C進行40分鐘，然后85°C5分鐘使酶失活。堿性憐酸酶處理后，針對SNP的單堿基延伸引物在下列反應體系中 進行：0. 755μ1 水、0. 2μ1 10XiPLEX緩沖液、0. 2μ1 終止混合物、0. 041μ1iPLEX酶 (Sequenom)，0. 804μ1 10μΜ的延伸引物。 W64] 單堿基延伸反應在下列條件下進行：94°C30秒；94°C5秒，52°C5秒，80°C5 秒5個循環(huán)，共40個循環(huán)；最后72°C3分鐘。在終止反應物中加入6mg陽離子交換樹脂 (Sequenom)脫鹽，混合后加入 25μ1 水懸浮。使用MassARRAYNanodispenser(Sequenom) 將最終的分型產(chǎn)物點樣到一塊384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用基質(zhì)輔助激光解 吸電離飛行時間質(zhì)譜進行分析。最終結果由MassARRAYRT軟件系統(tǒng)（版本號3. 0. 0. 4)實 時讀取，并由MassARRAYTyper軟件系統(tǒng)（版本號3. 4)完成基因分型分析（見圖2)。圖2 中，橫座標為質(zhì)譜分子量單位（道爾頓），縱座標為不同等位基因光強度值。CXCR1-816位 點檢測范圍在5680-5720道爾頓間，其中A基因檢測分子量為5708左右，C基因檢測分子量 為5680左右。如在相應檢測分子量處有較高的光強度值，則表示該個體具有該等位基因。 如在運2個分子量處有雙峰，則該個體為雜合子。如上3張圖分別表示CXCR1-816位點3 種不同的基因型（AA、AC和CC)。 W65] 實施例3
[0066] 通過大樣本數(shù)據(jù)化47頭奶牛）分析表明（見表1) :CXCR1基因816A/C突變顯著 影響奶牛生產(chǎn)壽命，CC型奶牛極顯著低于AA和AC型奶牛，CC型奶牛提前淘汰3個月左右。 Cox生存分析表明：CXCR1基因4個SNP突變位點中，只有816位點對奶牛生產(chǎn)壽命的影響 達到顯著水平（見表2)，CXCR1-816位點不同基因型1-5胎內(nèi)的累積生存概率CC型個體在 24月齡后其累積生存概率均低于AA和AC型（見圖3)。因此，在常規(guī)奶牛育種工作中，增 加本研究發(fā)現(xiàn)的分子標記CXCR1-816 (A/C)檢測，篩選其中AA型個體公牛，并與其它母牛進 行配種，可增加其后代母牛CXCR1-816AA和AC型個體比例，逐漸淘汰CC型母牛個體。
[0067] 表1 :奶牛CXCR1-816位點不同基因型離群月齡和離群胎次的平均數(shù)、標準差與方 差分析：
[0068]
[0069] 注：同列不同上標表示差異顯著（P<0. 05)
[0070] 在全國各種公牛站進行常規(guī)奶牛育種工作中，增加本研究發(fā)現(xiàn)的分子標記 CXCR1-816 (A/C)檢測，篩選其中AA型個體公牛，并與母牛進行配種，可增加其后代母牛 CXCR1-816AA和AC型個體比例，逐漸淘汰后代中CC型母牛。按AA和AC型母牛比CC型母 牛多產(chǎn)奶90天左右，目前平均產(chǎn)奶水平25kg/天、4元/kg奶價格計算，AA和AC型奶?？?增加產(chǎn)值900元左右。如按目前中國荷斯坦牛1000萬頭計算，共可增產(chǎn)90億元。同時可 減少因淘汰奶牛而購買其他奶牛的所產(chǎn)生的費用。因此，如運一技術能在全國范圍內(nèi)推廣 應用，其間接產(chǎn)值可增加100億元W上。 陽〇7U 表2 :奶牛CXCR1基因4個SNP突變位點對其生產(chǎn)壽命的顯著性檢驗：
[0072]
[0073] 注：顯著水平小于或等于0. 05表示該位點對生產(chǎn)壽命達到顯著水平。
[0074] W上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術 人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，本發(fā)明 要求保護范圍由所附的權利要求書、說明書及其等效物界定。 陽0巧]
[0076]
【主權項】
1. 一種用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標記檢測方法，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 從樣品中提取DNA; 2) 以提取的DNA為樣本，使用用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標記引物進行PCR擴 增； 3) 檢測步驟2)中的PCR產(chǎn)物的序列，根據(jù)分子標記，即：CXCR1基因第816位點的SNP 突變基因型，對奶牛生產(chǎn)壽命進行輔助選擇。2. 如權利要求1所述的一種用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標記檢測方法，其特征 在于，步驟3)中使用普通測序法檢測PCR產(chǎn)物序列，且其在步驟2)中使用的用于奶牛生產(chǎn) 壽命輔助選擇的分子標記引物的核苷酸序列為： 上游引物為：5' -ATGACAATCATCCTGAAAGA-3' ； 下游引物為：5' -TCAGAGGGTAGTAGACGTGT-3'。3. 如權利要求1所述的一種用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標記檢測方法，其特征 在于，步驟3)中使用飛行時間質(zhì)譜法檢測PCR產(chǎn)物序列，且其在步驟2)中使用的用于奶牛 生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標記引物的核苷酸序列為： cxcrl-816-F5' -ACGTTGGATGTCATCTTTGCTGTCGTGCTC-3' ； cxcrl-816-R5' -ACGTTGGATGAGGTCTCAGCAATCACATGG-3' ； 且其在步驟3)中的飛行時間質(zhì)譜法檢測時使用的針對SNP的單堿基延伸引物的核苷 酸序列為： cxcrl-816-U5' -CTACAACCTGGTCCTGAT-3'。4. 如權利要求1中步驟3)所述的分子標記在與奶牛生產(chǎn)壽命相關的判定或者檢測中 的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種對奶牛生產(chǎn)壽命進行輔助選擇的檢測方法，包括以下步驟：1)從樣品中提取DNA；2)以提取的DNA為樣本，使用用于奶牛生產(chǎn)壽命輔助選擇的分子標記引物進行PCR擴增；3)檢測步驟2)中的PCR產(chǎn)物的序列，根據(jù)CXCR1基因第816位點的SNP突變，判定其樣品的基因型為AA，AC或者CC型。本發(fā)明首次披露了CXCR1-816的SNP突變位點的基因型在對奶牛生產(chǎn)壽命進行輔助選擇方面的應用。相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明設計分子標記引物時使用的CXCR1基因與奶牛生產(chǎn)性能、免疫和疾病等性狀密切相關，其SNP突變標記點與奶牛生產(chǎn)壽命顯著相關，具有更高的準確性和可信度，因而可以有效地針對奶牛生產(chǎn)壽命對種牛進行輔助選擇，以提高后代奶牛的生產(chǎn)壽命，并間接地提高產(chǎn)值。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105368941
【申請?zhí)枴緾N201510770238
【發(fā)明人】毛永江, 朱小瑞, 邢世宇, 王文強, 張慧敏, 楊章平
【申請人】揚州大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月12日