用于產(chǎn)生雙等位基因敲除的方法和組合物的制作方法
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[0001] 本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2013年7月19日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)Serial Νο·61/856,579 的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)的內(nèi)容在此以其全文形式被援引加入本文。涉及的序列表、表格或計(jì)算 機(jī)程序
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【背景技術(shù)】
[0003] 已經(jīng)表明基因敲除技術(shù)在生物研究中具有巨大的價(jià)值。通過(guò)同源重組的傳統(tǒng)基 因阻斷技術(shù)是費(fèi)力并且不可預(yù)測(cè)的過(guò)程。近年來(lái)開(kāi)發(fā)的靶向基因組編輯更為有效的多，并 可通過(guò)在染色體中的靶向雙鏈斷裂（DSB)來(lái)實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)的示例利用了成簇的規(guī)律間隔 的短回文重復(fù)序列（CRISPR)、鋅指核酸酶（ZFN)或類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN) (Esvelt and Wang, Mol. Syst.Biol. ,2013,9:641)。其中，CRISPR 是最通用的基因組編輯 工具，這是因?yàn)槠浣柚谂c基因組修飾位點(diǎn)互補(bǔ)的特異性RNA序列的靶向機(jī)制。CRISPR允 許通過(guò)利用成簇的靶向RNA序列在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因組編輯。細(xì)胞中的DSB通過(guò)非同源末 端連接（NHEJ)修復(fù)，在低頻導(dǎo)致可能產(chǎn)生移碼和滅活感興趣基因的小插入或缺失（插入缺 失）。
[0004] 使用大多數(shù)方法，基因組編輯率是較低的，通常小于5%。評(píng)定基因組編輯、利用 Swveyor⑩核酸酶分析（Transgenomic, Inc.，Omaha, NE)來(lái)檢測(cè)雙鏈體DNA錯(cuò)配或深度測(cè) 序的最常用的方法不區(qū)分單等位基因或雙等位基因突變。由于在單個(gè)步驟中產(chǎn)生雙等位基 因突變的可能性是可忽略不計(jì)的，一般要求兩步驟（2步驟）序列基因組編輯。
[0005] 治療性抗體是在過(guò)去二十年開(kāi)發(fā)的成功的新藥物類(lèi)別。FDA已批準(zhǔn)了超過(guò)三十種 重組治療性抗體，用于治療不同的疾病，包括癌癥、病毒感染、器官移植排斥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎和其它自身免疫性病癥。更多的治療性抗體處于臨床試驗(yàn)中，用于日益擴(kuò)大的疾病種類(lèi)。 隨著分子生物學(xué)的出現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生重組抗體已成為可能（N. Yamane-Ohnuki and M. Satoh，mAbs，2009, 1 (3):230-236)〇
[0006] 針對(duì)可溶性因子（例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或腫瘤壞死因子）的抗體治療的目的 僅僅在于通過(guò)免疫復(fù)合物形成來(lái)降低游離配體濃度。相比之下，當(dāng)抗體治療是針對(duì)細(xì)胞 表面抗原時(shí)（如同通常在抗腫瘤免疫治療中的情況），目標(biāo)通常是去除引起疾病的細(xì)胞本 身?？贵w依賴(lài)性細(xì)胞（介導(dǎo)）的細(xì)胞毒作用（ADCC)--種對(duì)抗體靶向細(xì)胞的溶解性攻擊， 在淋巴細(xì)胞受體（例如，F(xiàn)cyRs)通過(guò)抗體的恒定區(qū)（Fe)結(jié)合時(shí)被觸發(fā)，所述抗體在大多 數(shù)情況下為免疫球蛋白亞類(lèi)I (IgGl)。ADCC被視為是一些治療性抗體的主要功能，雖然抗 體具有多種治療功能（例如，抗原結(jié)合、誘導(dǎo)凋亡、和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用） (T. Shinkawa 等人，J. Bio. Chem.，2003, 278 (5): 3466-3473)。在 ADCC 中，自然殺傷（NK)細(xì) 胞主要經(jīng)由與NK細(xì)胞的FcyRIII受體的相互作用而識(shí)別抗體的恒定（Fe)區(qū)，然后激活細(xì) 胞溶解和細(xì)胞凋亡。
[0007] Fc-Fc γ RIII相互作用對(duì)Fc糖基化極為敏感。非糖基化的（aglycosylated)抗 體（例如，由非哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)生的那些）不能結(jié)合Fc受體（Leatherbarrow等人， Mol. Tmmun.，1985, 22:407-15 ;Walker 等人，Biochem. J.，1989, 259:347-53 ;Leader 等人， Immunology，1991，72:481-5)。另一方面，附接至Fc區(qū)的Asn297的糖鏈的巖藻糖基化降 低了與Fe YRIII的結(jié)合并且降低了體外ADCC活性（Shields等人，J. Biol. Chem.，2002， 277:26733-40 ;Shinkawa 等人，J. Biol. Chem.，2003, 278:3466-73 ;Niwa 等人，CancerRes.， 2004,64:2127-33)。
[0008] 大多數(shù)的哺乳動(dòng)物免疫球蛋白被巖藻糖基化，包括由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CH0細(xì) 胞）產(chǎn)生的那些（Jefferis 等人，Biochem J.，1990, 268:529-37 ;Raju 等人，Glycobiology， 2000,10:477-86)。巖藻糖經(jīng)由α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FUT8)蛋白產(chǎn)生的α-1，6鍵附接 至 Fc 核心區(qū)（Oriol 等人，Glycobiology，1999,9:323-34 ;Costache 等人，J. Biol. Chem.， 1997,272:29721-8)。CHO細(xì)胞中Fut8基因的阻斷/破壞可消除抗體的核心巖藻糖基化并 可增大 ADCC ~100 倍（Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioengin.，2004,87 (5) :614-622)。
[0009] 已使用基因組編輯通過(guò)敲低/敲降或敲除FutS等位基因來(lái)降低或消除FUT8活 性。Imai-Nishiya等人已經(jīng)披露了 Fut8和GMD的雙敲低，利用siRNA串聯(lián)表達(dá)載體靶 向這些基因并將其引入IgGl抗體產(chǎn)生CH0/DG44 32-05-12細(xì)胞（BMCBiotechnology， 2007, 7:84 ;doi: 10. 1186/1472-6750-7-84)。為了產(chǎn)生雙等位基因 Fut8 敲除 CHO 細(xì) 胞，Yamane-Ohnuki等人披露了 一種兩步序列同源重組工藝（Biotech. Bioengin.，2004， 87(5):614-622)來(lái)克服低頻率的同源重組。類(lèi)似地，Collingwood披露了一種靶向ZFN 方法來(lái)敲除CHOK細(xì)胞中的兩個(gè)FutS等位基因，這是通過(guò)在致死量的小扁豆凝集素（LCA) 存在的情況下連續(xù)培養(yǎng)來(lái)富集FutS裸細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，利用了由LCA與巖藻糖的特異性結(jié) 合所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性（W0 2009/009086 ;L. Malphettes 等人，Biotech. Bioengin.，2010， 106(5) :774-783)。
[0010] 此外，可能希望產(chǎn)生其中除Futs基因外的其它基因被部分或全部抑制的細(xì)胞系。 因?yàn)榛蚪M編輯率低，通常小于5%，因此可合理地假定通過(guò)單個(gè)crRNA位點(diǎn)產(chǎn)生雙等位基 因突變的可能性是可忽略不計(jì)的?？赡鼙仨氁M(jìn)行序列基因組編輯，以便獲得雙等位基因 敲除。例如，Cong等人披露了在兩個(gè)內(nèi)源基因（EMXl和PVALB)和在同一 EMXl基因的兩個(gè) 靶位點(diǎn)中成功的基因組編輯（Science，2013, 339:819-823)。不過(guò)，當(dāng)靶向EMXl基因中的2 個(gè)原型間隔序列時(shí)，缺失效率僅為1. 6%，并且沒(méi)有報(bào)告雙等位基因敲除。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種通過(guò)為真核細(xì)胞提供CRISPR系統(tǒng)在真核細(xì)胞中 產(chǎn)生雙等位基因敲除的方法，所述CRISPR系統(tǒng)包括核酸酶和與靶基因中的DNA間隔序列互 補(bǔ)的至少兩個(gè)革G向RNA。在一個(gè)實(shí)施例中，相同的tracrRNA可與多個(gè)不同的crRNA -起使 用，并且許多crRNA可用單個(gè)tracrRNA組織。在一個(gè)實(shí)施例中，CRISPR系統(tǒng)包括至少三個(gè) 或四個(gè)靶向RNA。在一個(gè)實(shí)施例中，多個(gè)CRISPR靶（crRNA靶）在相同的基因中。在一個(gè)實(shí) 施例中，多個(gè)CRISPR靶在基因的相同外顯子中。在一個(gè)實(shí)施例中，多個(gè)CRISPR靶在基因的 500bp、450bp、400bp、375bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、lOObp、或 50bp 內(nèi)。在一個(gè) 實(shí)施例中，真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、CHOS 細(xì)胞、293細(xì)胞、NSO細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、或其衍生物、或抗體產(chǎn)生細(xì)胞或其衍生物。在另一實(shí) 施例中，核酸酶是Cas變體。在另一個(gè)實(shí)施例中，Cas變體核酸酶是Cas9。在一個(gè)實(shí)施例 中，革巴向RNA由tracrRNA和crRNA構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施例中，tracrRNA和crRNA可由發(fā)夾 RNA連接物連接。在另一個(gè)實(shí)施例中，靶基因是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，靶向 的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因是Fut8, a-(1-6)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，靶基因是 谷氨酰胺合成酶。在另一個(gè)實(shí)施例中，靶基因是二氫葉酸還原酶（DHFR)。在另一個(gè)實(shí)施例 中，靶基因是唾液酸酶。
[0012] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的方法使Fut8敲除的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一 個(gè)實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括Fut8敲除細(xì)胞，所述Fut8敲除細(xì)胞在熒光標(biāo)記細(xì)胞表面巖 藻糖之后通過(guò)FACS對(duì)陰性熒光信號(hào)分離出來(lái)的。在一個(gè)實(shí)施例中，熒光標(biāo)記包括與熒光素 標(biāo)記的小扁豆凝集素（LCA-FITC)的結(jié)合。
[0013] 在另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的方法使谷氨酰胺合成酶敲除的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。
[0014] 另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的方法使DHFR敲除的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0015] 另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的方法使唾液酸酶敲除的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0016] 另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的方法使其它靶基因敲除的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0017] 另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的方法由使FutS敲除的真核細(xì)胞產(chǎn)生的無(wú)巖 藻糖基化蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，無(wú)巖藻糖基化蛋白是抗體。在另一實(shí)施例中，抗體是利妥 昔單抗。
[0018] 另一方面，本發(fā)明包括質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含編碼Cas9蛋白的核苷酸，以及crRNA 和tracrRNA中之一或兩者，其中質(zhì)粒是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，并且其中當(dāng)crRNA和 tracrRNA均存在時(shí)，它們可選地由發(fā)夾RNA連接物連接。在一個(gè)實(shí)施例中，質(zhì)粒包括crRNA 和tracrRNA中之一或兩者，其中利用了能夠革El向Cas9染色體位點(diǎn)的crRNA或tracrRNA的 部分序列。在另一實(shí)施例中，crRNA由靶基因的至少兩個(gè)原型間隔序列組成。在另一個(gè)實(shí) 施例中，Cas9蛋白表達(dá)通過(guò)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)。在另一實(shí)施例中，啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。在 另一個(gè)實(shí)施例中，tracrRNA通過(guò)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)。在另一實(shí)施例中，crRNA通過(guò)啟動(dòng)子進(jìn)行 表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)發(fā)夾RNA連接物與tracrRNA連接的crRNA通過(guò)啟動(dòng)子進(jìn)行 表達(dá)。在另外的實(shí)施例中，tracrRNA啟動(dòng)子和crRNA啟動(dòng)子是人U6啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí) 施例中，質(zhì)粒還包括抗生素抗性基因。在另一實(shí)施例中，抗生素是氨芐青霉素。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中本發(fā)明的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染有至少一個(gè)含有 Cas9的質(zhì)粒。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中本發(fā)明的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染有至少一個(gè)含有 crRNA的質(zhì)粒。
[0021] 另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，其中本發(fā)明的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染有至少一個(gè)含有通 過(guò)發(fā)夾RNA連接物與tracrRNA連接的crRNA的質(zhì)粒。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖IA-C示意性地示出了 Cas9介導(dǎo)的序列特異性DNA裂解：圖IA示出了通常的 CRISPR系統(tǒng)，其具有三個(gè)組成部分：Cas9蛋白和兩個(gè)小RNA(crRNA和tracrRNA) ;crRNA含 有與靶向DNA互補(bǔ)的序列（間隔序列加上NGG) ;tracrRNA含有與crRNA互補(bǔ)的序列；野生 型Cas9導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂，而Cas9-D10A導(dǎo)致單鏈DNA斷裂。圖IB示出了本發(fā)明的經(jīng)修 飾的CRISPR系統(tǒng)，其具有兩個(gè)組成部分：Cas9蛋白以及結(jié)合crRNA和tracrRNA的序列的 單個(gè)gRNA，其中g(shù)RNA含有與靶向DNA互補(bǔ)的序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。圖IC示出了含有3個(gè)不同 的靶向間隔區(qū)的crRNA的示意圖；DR是指同向重復(fù)序列，而T1、T2、和T3是靶向序列。
[0023] 圖2Α-Β示出了 Cas9介導(dǎo)的基因靶向系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 LB200和LB221 ;Cas9通過(guò)CMV啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；tracrRNA通過(guò)人