U6啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。圖 2A示出了載體LB200。圖2B示出了載體LB221，其中IRES-GFP盒被插在Cas9之后。
[0024] 圖3示出了 Cas9介導(dǎo)的基因革El向系統(tǒng)的質(zhì)粒圖譜，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 LB202a ;DR-T1-DR的crRNA通過人U6啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
[0025] 圖4A-B示出了在引入靶向Fut8的CRISPR系統(tǒng)之前和之后在CHOS細(xì)胞上的巖藻 糖的LCA-FITC染色。圖4A示出了沒有LCA-FITC染色的陰性對照CHOS細(xì)胞和在野生型 CHOS細(xì)胞中具有LCA-FITC染色的陽性對照巖藻糖。圖4B示出了在引入具有單個(gè)靶向RNA 或crRNA的CRISPR系統(tǒng)之后在CHOS細(xì)胞上的巖藻糖的LCA-FITC染色。
[0026] 圖5A-C示出了在引入具有1-10個(gè)靶向RNA或crRNA的靶向Fut8的CRISPR系統(tǒng) 之前和之后在CHOS細(xì)胞上的巖藻糖的LCA-FITC染色。圖5A示出了沒有LCA-FITC染色的 陰性對照CHOS細(xì)胞和在野生型CHOS細(xì)胞中具有LCA-FITC染色的陽性對照巖藻糖。圖5B 示出了在引入具有一（1)到十（10)個(gè)靶向RNA或crRNA的CRISPR系統(tǒng)之后在CHOS細(xì)胞 上的巖藻糖的LCA-FITC染色。圖5C示出了在LCA-FITC染色之前和之后的CHOS細(xì)胞，以 及從標(biāo)記為2. 123. 3P的轉(zhuǎn)染#5 (三個(gè)靶向RNA)和標(biāo)記為2. 123. 4P的轉(zhuǎn)染#6 (四個(gè)靶向 RNA)的M2池克隆的細(xì)胞的LAC-FITC染色。
[0027] 圖6A-C示出了巖藻糖的LCA-FITC染色（圖6A);序列比對（圖6B :Fut8外顯子 I-SEQ ID N0:1 ;突變體I-SEQ ID N0:2 ;突變體2-SEQ ID N0:3 ;和突變體3-SEQ ID N0:4); 以及從轉(zhuǎn)染#5 (三個(gè)靶向RNA)的M2峰分離出的克隆的轉(zhuǎn)染率（圖6C)。突變體1和3來自 細(xì)胞系2. 123-4,而突變體2來自細(xì)胞系2. 123-6。從轉(zhuǎn)染#5的M2峰分離的其它突變體細(xì) 胞系是 2. 123-U2. 123-1U2. 123-12、2· 123-13、2· 123-15、2· 123-20、2· 123-23、2· 123-25、 和 2. 124-6。
[0028] 圖7示出了在野生型CHOS細(xì)胞以及具有Fut8的雙等位基因敲除的CHOS細(xì)胞中 進(jìn)行的利妥昔單抗（美羅華，Rituxan)和曲妥珠單抗（赫賽汀，Herceptin)的聚糖分析。
[0029] 圖8A-B示出了在野生型CHOS細(xì)胞以及具有Fut8的雙等位基因敲除的CHOS細(xì)胞 中所得的利妥昔單抗（Rituxan)和曲妥珠單抗（Herceptin)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞 毒性作用。圖8A示出了在野生型CHOS細(xì)胞以及具有Fut8的雙等位基因敲除的CHOS細(xì)胞 中所得的利妥昔單抗（Rituxan)的ADCC活性。圖8B示出了在野生型CHOS細(xì)胞以及具有 Fut8的雙等位基因敲除的CHOS細(xì)胞中所得的曲妥珠單抗（Here印tin)的ADCC活性。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明通過示例而非通過限制的方式進(jìn)行闡述。應(yīng)當(dāng)指出，本文中提及一個(gè)/ 一 種（"an"）或一個(gè)/ 一種（"one"）或"一些（some)"實(shí)施例并不必然指同一實(shí)施例，所有 這樣的提及意味著至少一個(gè)。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，而復(fù)數(shù)術(shù) 語應(yīng)包括單數(shù)。在本申請中，除非另有說明，"或（or)"的使用意味著"和/或"。此外，術(shù)語 "包括（including)"以及其它形式的使用，例如"包括（includes)"和"包括（included)"， 不是限制性的。
[0031] 除非本文中另行規(guī)定，結(jié)合本發(fā)明所用的科技術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通 常理解的含義。這些術(shù)語的含義和范圍應(yīng)當(dāng)是清楚的，不過，如果存在任何潛在的歧義，本 文提供的定義優(yōu)先于任何詞典或外來定義。
[0032] -般而言，與本文所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué) 和蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)以及雜交結(jié)合使用的術(shù)語及其技術(shù)是本領(lǐng)域公知且常用的。除非另有 說明，本發(fā)明的方法和技術(shù)一般根據(jù)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行，所述傳統(tǒng)的方法是本領(lǐng)域公知的并 且如貫穿本說明書所引用和討論的不同的一般參考文獻(xiàn)和更為特定的參考文獻(xiàn)中所述。酶 促反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商的說明書、如本領(lǐng)域通常實(shí)現(xiàn)的或如本文所述來進(jìn)行。為了 本發(fā)明可以更易于理解，下文定義了選定的術(shù)語。
[0033] 本文所用的術(shù)語"抗體"廣義地是指由四個(gè)多肽鏈（兩個(gè)重（H)鏈和兩個(gè)輕（L) 鏈）組成的任何免疫球蛋白（Ig)分子、或任何功能性片段、突變體、變體、或其衍生物（保 留了 Ig分子的基本表位結(jié)合特征），包括例如基本上由免疫球蛋白基因、免疫球蛋白基因 的片段、雜合免疫球蛋白基因（通過組合來自不同動(dòng)物的遺傳信息而得）、或合成免疫球蛋 白基因編碼的一種或多種多肽，或單鏈抗體、Fab、F (ab) 2、scFv、dAB、VHH、駱駝抗體、或納米 抗體。所述突變體、變體或衍生抗體形式是本領(lǐng)域已知的。其非限制性實(shí)施例在下文討論。
[0034] 在全長抗體中，每條重鏈由重鏈可變區(qū)（在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定 區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)功能區(qū)CH1、CH2和CH3組成。每個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)（本文縮 寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)功能區(qū)CL組成。VH和VL區(qū)可被 進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，穿插有稱為框架區(qū)（FR)的更保守的區(qū)域。每 一 VH和VL由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR組成，從氨基端至羧基端按以下順序排列：FRl、⑶Rl、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何類型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、類別（例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類。
[0035] 本文所用的"分離抗體"意指基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體 (例如，特異性結(jié)合在正常和惡性B淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原的分離抗體）。不過， 特異性結(jié)合CD20抗原的分離抗體對其它抗原例如來自其它種的CD20分子可能具有交叉反 應(yīng)性。此外，分離抗體可基本無其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。
[0036] 本文所提及的術(shù)語"多核苷酸"意指2個(gè)或更多核苷酸的聚合形式，或者是核糖核 苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類型核苷酸的修飾形式。術(shù)語包括單鏈形式和雙鏈形式的 DNA，但具體地是雙鏈DNA。
[0037] 本文使用的術(shù)語"分離的多核苷酸"應(yīng)表示一種多核苷酸（例如，基因組的、cDNA、 或合成來源，或其某一組合），由于其來源，"分離的多核苷酸"不與在自然界中隨之發(fā)現(xiàn)"分 離的多核苷酸"的多核苷酸的全部或一部分關(guān)聯(lián)；可操作地連接至自然界不存在的多核苷 酸；或在自然界中不作為較大序列的部分出現(xiàn)。
[0038] 本文所用的術(shù)語"載體"意指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一核酸的核酸分子。一種類 型的載體為"質(zhì)粒"，其指的是另外的DNA片段可連接入其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。某些載體 能夠引導(dǎo)它們可操作地連接的基因的表達(dá)。所述載體在本文被稱為"重組表達(dá)載體"（或者 簡稱為"表達(dá)載體"）。一般而言，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體常常為質(zhì)粒的形式。在本 說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換地使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。不過，本發(fā)明旨 在包括可以發(fā)揮等同功能的此類其它形式的表達(dá)載體。在細(xì)胞內(nèi)部，載體和/或質(zhì)?？稍?染色體外存在或整合到宿主細(xì)胞DNA中。
[0039] 術(shù)語"可操作地連接（operably linked) "是指其中所述的組成部分處于允許它們 以其預(yù)期方式起作用的關(guān)系的并置。與編碼序列"可操作地連接"的控制序列以這樣的方 式接合/連接，使得編碼序列的表達(dá)在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)。"可操作地連接"的 序列包括與感興趣的基因鄰接的表達(dá)控制序列，和以反式或在遠(yuǎn)處起作用以控制感興趣基 因的表達(dá)控制序列。本文所用的術(shù)語"表達(dá)控制序列"是指實(shí)現(xiàn)它們所連接的編碼序列的 表達(dá)和加工所需的多核苷酸序列。表達(dá)控制序列包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng) 子序列；有效的RNA加工信號例如剪接和多腺苷酸化信號；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列；增強(qiáng) 翻譯效率的序列（即，Kozak共有序列）；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；和在需要時(shí)，增強(qiáng)蛋白 質(zhì)分泌的序列。所述控制序列的性質(zhì)取決于宿主生物體而不同；在真核細(xì)胞中，一般所述控 制序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語"控制序列"旨在包括其存在對于表達(dá)和加工是 必要的組成部分，并且還可以包括其存在是有利的其它組成部分，例如前導(dǎo)序列和融合伴 侶序列（fusion partner sequence) 〇
[0040] 術(shù)語"將純化DNA引入真核宿主細(xì)胞"或"轉(zhuǎn)染"表示其中具有或沒有伴隨物質(zhì)的 細(xì)胞外DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的任何過程。術(shù)語"經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（cell transfected) "或"轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞（transfected cell) "表示細(xì)胞外DNA已被引入并因而包含細(xì)胞外DNA的細(xì)胞。 DNA可能被引入細(xì)胞，使得核酸可復(fù)制作為染色體組成部分（chromosomal integrant)或 作為染色體外元件。本文所用的"啟動(dòng)子（promoter)"是指調(diào)芐基因表達(dá)的核酸序列。
[0041] 本文所用的術(shù)語"重組宿主細(xì)胞"（或簡稱為"宿主細(xì)胞"）意指其中已引入外源 DNA的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，所述術(shù)語不僅意指特定的受試細(xì)胞，還意指此類細(xì)胞的后代。由于突 變或環(huán)境影響而在后續(xù)代中可能發(fā)生某些修飾，事實(shí)上這樣的后代可能不與親代細(xì)胞（母 細(xì)胞）相同，但仍被包括在本文所用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。尤其是，宿主細(xì)胞包括 真核細(xì)胞。
[0042] "真核細(xì)胞"是指任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞（來自真核生物）。作為非 限制性實(shí)例，能夠在細(xì)胞培養(yǎng)條件下維持并且隨后被轉(zhuǎn)染的任何真核細(xì)胞都將包括在本發(fā) 明中。特別優(yōu)選的細(xì)胞類型包括，例如，干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO)、293 細(xì)胞、NSO細(xì)胞、C0S、BHK21、NIH3T3、HeLa、C2C12、癌細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、以及原代分 化細(xì)胞或未分化細(xì)胞。其它適合的宿主細(xì)胞對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是已知的。
[0043] "感興趣基因 （gene of interest)"或"轉(zhuǎn)基因"優(yōu)選地編碼蛋白質(zhì)（結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié) 蛋白）。本文所用的"蛋白質(zhì)"一般是指具有多于約十個(gè)氨基酸的肽和多肽。蛋白質(zhì)對于宿 主可以是"同源的"（即，對于被利用的宿主細(xì)胞而言是內(nèi)源的）、或"異源的"（即，對于被 利用的宿主細(xì)胞而言是外來的），例如由酵母產(chǎn)生的人類蛋白?？僧a(chǎn)生蛋白質(zhì)為不溶性聚集 物或?yàn)榭扇苄缘鞍子诩?xì)胞的胞質(zhì)周圍間隙或胞質(zhì)中、或細(xì)胞外介質(zhì)中。
[0044] 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化（例如，電穿孔、脂質(zhì) 轉(zhuǎn)染）。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)可以按照制造商的說明書或如本領(lǐng)域通常所完成、或如本 文所述來進(jìn)行。前述技術(shù)和程序可大體按照本領(lǐng)域所公知的傳統(tǒng)方法和如貫穿本說明書 所引證和討論的不同通用和更具體的文獻(xiàn)中所述來進(jìn)行。說明性的方法披露于Current Protocols in Immunology(編輯：Coligan，J.E.等人，John Wiley&Sons, NY, NY, 2001)， Ausubel 等人，Current Protocols in Molecul arBiology, Greene Publ. Assoc. Inc. &John Wiley&Sons，Inc.，NY, NY, 2001)，Sambrook等人（Molecular Cloning，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview，NY，2001)以及別處。 本發(fā)明的概述
[0045] 本發(fā)明利用CRISPR系統(tǒng)以阻斷/破壞真核細(xì)胞中的靶基因。更具體地說，系統(tǒng)瞬 時(shí)表達(dá)Cas9、tracrRNA(單個(gè)或多個(gè)）、和多個(gè)crRNA，其靶向真核細(xì)胞例如CHO細(xì)胞、293 細(xì)胞、NSO細(xì)胞、或任何抗體產(chǎn)生細(xì)胞中的感興趣基因的多個(gè)外顯子位點(diǎn)。相比于公開的 CRISPR方法，本發(fā)明的系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)在于，它通過利用相同系統(tǒng)中的多個(gè)crRNA序列在 一個(gè)步驟中特定敲除兩個(gè)靶向等位基因。涉及CRISPR的大多數(shù)公開文獻(xiàn)利用Surveyor? 核酸酶分析/測定（Tr