以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制革專用固定化酶制備的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脫毛是通過(guò)一系列物理、化學(xué)的方法使毛脫離真皮或被溶解的過(guò)程。傳統(tǒng)灰堿脫毛法，脫毛效果好，干凈且迅速，操作簡(jiǎn)便，容易控制，但對(duì)膠原纖維松散作用好，且對(duì)皮的破壞不大，脫毛裸皮粒紋清晰。但是硫化物的污染嚴(yán)重，且大量角蛋白水解使得廢水中有機(jī)物含量大大提高，同時(shí)產(chǎn)生大量堿性污泥，難以處理。酶法脫毛法與傳統(tǒng)灰堿脫毛法相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是酶法脫毛是保毛法脫毛，能回收高質(zhì)量的毛，在脫毛過(guò)程中不產(chǎn)生無(wú)毒無(wú)害氣體，污染很小，不僅消除了硫化物污染，還可以減小廢水中的B0D和固體懸浮物含量。
但是目前在皮革工業(yè)中采用的酶法脫毛法主要存在以下缺點(diǎn):(1)酶制劑的穩(wěn)定性差，容易失活；(2)酶制劑通常與其它材料在同體系中使用，工序中使用的某些材料容易導(dǎo)致酶的失活；(3)酶的催化活性過(guò)高，工藝可控性差。因此，有必要研究固定化酶在制革領(lǐng)域中的應(yīng)用，以形成保護(hù)和緩釋之效果，增強(qiáng)制革專用酶制劑的耐用性和延長(zhǎng)酶促反應(yīng)時(shí)間，但在固定化酶技術(shù)中，載體的選擇對(duì)固定化酶的活性及使用特性有著至關(guān)重要的作用，為了得到具有良好催化性能、載量高、成本低的固定化酶，現(xiàn)有技術(shù)利用了價(jià)格低廉，易得的天然高分子，如:活性炭、娃藻土、明鞏、殼聚糖以及海藻酸I丐等作為固定化載體，其中，殼聚糖、海藻酸鈣作為固定化載體的研究比較廣泛，但使用這些天然高分子作為固定化酶載體時(shí)，由于它們與酶的相容性及親和性有限，得到的固定化酶中的酶的固載量及活力較低。而且常規(guī)酶法脫毛，大部分脫毛酶對(duì)皮內(nèi)組分的作用沒(méi)有針對(duì)性，在脫毛的同時(shí)能大量水解膠原，條件上不易控制，操作不當(dāng)，會(huì)使皮松面、爛面，且毛通常不能完全除去。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]因此，針對(duì)上述的問(wèn)題，本發(fā)明提出一種以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶及其制備方法。所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)楣潭ɑ赣幂d體，該載體親水性好，且有較高的機(jī)械強(qiáng)度，空隙多，多孔性賦予了微球?qū)γ赣泻芎玫奈锢砦叫阅埽軌蛴行?shí)現(xiàn)酶的固定化，提升酶的固載量和活力，并且采用所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶進(jìn)行脫毛處理后的裸皮皮面潔白，粒面毛孔清晰，脫毛完全，并且該脫毛過(guò)程簡(jiǎn)單易操作，實(shí)用性高。而且所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法工藝簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，適合大批量化生產(chǎn)使用。
為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的解決方案為:
以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶，具有如下性質(zhì):
(1)外觀:米白色粉末；(2)pH 值:5.0-7.5 ；
(3)干燥失重8%；
(4)酶活力:20000u/g；
(5)酶活殘留率:多99%；
(6)砷含量:0.001% ；
(7)重金屬含量:0.001%。
上述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法，包括如下步驟:
步驟1、制備多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球；
步驟2、將100重量份多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球室溫下浸泡于1%的高碘酸溶液中60-240min，充分氧化后，過(guò)濾，洗滌，浸泡于100ml蒸餾水中，再加入10-15重量份1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺，并在20-30°C水浴中振蕩反應(yīng)60-120min，過(guò)濾并用去離子水洗去載體上殘留的碳化二亞胺；
步驟3、準(zhǔn)確稱取10g復(fù)合酶溶于1000 ml pH值為5.0-8.0的、離子強(qiáng)度為
0.l-0.5mol/L的緩沖液中，配制成復(fù)合脫毛酶溶液，然后于5°C、1500r/min下離心15min，收集上層清液；
步驟4、將步驟2的多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球加入到復(fù)合脫毛酶溶液中，使酶與多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球質(zhì)量比為1:1，于15-40°C水浴中振蕩反應(yīng)30-90min，過(guò)濾并用去離子水洗去載體上殘留的復(fù)合脫毛酶，即得到以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶。
進(jìn)一步的是，步驟3中所述復(fù)合酶為每100重量份復(fù)合酶中包含50-65重量份的中性蛋白酶、10-15重量份的α淀粉酶、5-10重量份糖化酶、10-15重量份的胰酶、5_8重量份的脂肪酶、2- 5重量份的彈性蛋白酶。
進(jìn)一步的是，步驟1包括如下步驟:步驟①、在90°C條件下將100重量份的聚乙烯醇溶于蒸餾水中制備聚乙烯醇溶液，所述聚乙烯醇與蒸餾水的比例為lg:20ml ;步驟②、在40-50°C，轉(zhuǎn)速200r/min，攪拌時(shí)間60min的條件下將100重量份的羧甲基纖維素溶于溶劑中制備羧甲基纖維素溶液，所述溶劑可為氫氧化鈉溶液、甲基嗎啉溶液、尿素溶液或氨水中的至少一種，所述羧甲基纖維素與溶劑的比例為lg:20ml ;步驟③、將步驟②所得的羧甲基纖維素溶液溶于油相中，所述羧甲基纖維素溶液與油相體積比為1:1，加入10-20重量份的乳化劑，在40-60°C、轉(zhuǎn)速600r/min的條件下，充分乳化90min后，以5ml/min的速度加入步驟①準(zhǔn)備好的聚乙烯醇溶液，持續(xù)攪拌120min后，鹽酸調(diào)節(jié)pH至3_5，保持轉(zhuǎn)速不變，攪拌30min ;步驟④、加入3-10重量份交聯(lián)劑，在40-60°C、轉(zhuǎn)速600r/min的條件下，攪拌180min ;步驟⑤、加入去離子水，去離子水作為固化劑，羧甲基纖維素溶液與去離子水的體積比為1: 3，加完去離子水后降低轉(zhuǎn)速150r/min，繼續(xù)攪拌10-30min ;步驟⑥、分液除去上層油脂，下層抽濾，依次用蒸餾水、丙酮、乙醇洗滌就可獲得多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球。
進(jìn)一步的是，步驟③中的油相可為蓖麻油、石蠟橄欖油中的至少一種；步驟③中的乳化劑可為乳化劑可為司班80、司班20、吐溫20、吐溫80中的至少一種；步驟④中的交聯(lián)劑為戊二醛。 通過(guò)采用前述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:如上所述設(shè)計(jì)的以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶及制備方法相較于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)勢(shì):
1、本發(fā)明所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)楣潭ɑ赣幂d體，該載體親水性好，且有較高的機(jī)械強(qiáng)度，空隙多，一方面經(jīng)過(guò)氧化的多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球的羧基與酶分子上的游離氨基存在一定的共價(jià)結(jié)合、多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球上的羥基與酶分子之間具有一定程度的親和力以及碳化二亞胺的共價(jià)連接等作用實(shí)現(xiàn)酶的固定化，另一方面多孔性賦予了微球?qū)γ赣泻芎玫奈锢砦叫阅?，因此，能夠有效?shí)現(xiàn)酶的固定化，提升酶的固載量和活力，酶具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，因此，將所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶用于生皮脫毛和分散膠原纖維，生產(chǎn)條件溫和，對(duì)皮膠原水解過(guò)程和膠原纖維的分離松散程度的可控性提高，可以避免生產(chǎn)中產(chǎn)品質(zhì)量的波動(dòng)，避免因可控性低操作不當(dāng)造成的皮松面、爛面、脫毛不完全的問(wèn)題；而且纖維素是最廉價(jià)最豐富的天然高分子材料之一，它容易被改性，同時(shí)易被降解，環(huán)保性好。
2、本發(fā)明所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法中所用復(fù)合酶包括有中性蛋白酶、α淀粉酶、糖化酶、胰酶、脂肪酶、彈性蛋白酶；其中，中性蛋白酶有利于硫酸皮膚素的除去，促進(jìn)束縛膠原纖維的環(huán)狀蛋白多糖被打開(kāi)，使纖維分散，使成革的柔軟性、強(qiáng)度顯著增加；加入糖化酶、淀粉酶可以除去蛋白多糖、糖蛋白，降低纖維的粘著性，使硫酸皮膚素從蛋白多糖上分離出來(lái)，除去纖維間質(zhì)，松散膠原纖維，以及破壞毛乳頭與毛之間的連接作用；脂肪酶作用于皮內(nèi)脂肪、脂腺、游離的脂肪細(xì)胞，達(dá)到脫脂及輔助脫毛的效果；彈性蛋白酶，可以適度水解彈性纖維，破壞彈性纖維對(duì)膠原纖維的及毛囊的“拉緊”效應(yīng)，使得纖維容易分離和松散，因此，所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶將各種酶混合使用，可以達(dá)到互補(bǔ)、協(xié)同的作用，從而大大地提高了酶脫毛的綜合性能，采用所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶進(jìn)行脫毛處理后的裸皮皮面潔白，粒面毛孔清晰，脫毛完全。
3、所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法工藝簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，適合大批量化生產(chǎn)使用。
【附圖說(shuō)明】
[0004]圖1、PF值對(duì)固定化復(fù)合脫毛酶和自由酶活力的影響結(jié)果示意圖。
圖2、溫度對(duì)固定化復(fù)合脫毛酶和自由酶活力的影響結(jié)果示意圖。
圖3、采用以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶脫毛后的裸皮示意圖。
圖4、采用以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶脫毛后的成革顯微鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0005]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。 需要說(shuō)明的是，以下實(shí)施例中所涉及的復(fù)合酶為每100份復(fù)合酶包含50-65份的中性蛋白酶、10-15份的α淀粉酶、5-10份糖化酶、10-15份的胰酶、5-8份的脂肪酶、2- 5份的彈性蛋白酶。
以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法:
步驟1、制備多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球，包括如下步驟:步驟①、在90°C條件下將5g聚乙烯醇溶于100ml的蒸餾水中制備聚乙烯醇溶液；步驟②、在50°C，轉(zhuǎn)速200r/min，攪拌時(shí)間60min的條件下將5g羧甲基纖維素溶于100ml溶劑中制備羧甲基纖維素溶液，所述溶劑為氫氧化鈉溶液；步驟③、將步驟①所得羧甲基纖維素溶液加入100ml蓖麻油中，加入lg司班80，在60°C、轉(zhuǎn)速600r/min的條件下，乳化60min，以5ml/min的速度加入步驟①準(zhǔn)備好的聚乙烯醇溶液，120min后，鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.5，保持轉(zhuǎn)速不變，保持30min ;步驟④、加入0.5g