戊二醛，在40-60°C、轉(zhuǎn)速600r/min的條件下，作用180min ;步驟⑤、加入300ml離子水，并降低轉(zhuǎn)速至150r/min，繼續(xù)攪拌10_30min ;步驟⑥、分液除去上層油脂，下層抽濾，依次用蒸餾水、丙酮、乙醇洗滌就可獲得多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球。
步驟2、將2g多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球室溫下浸泡于100ml的體積分?jǐn)?shù)為1%的高碘酸溶液中120min，充分氧化后，過濾，洗滌，浸泡于100ml的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的碳化二亞胺水溶液中，并在30°C水浴中振蕩反應(yīng)60min，過濾并用去離子水洗去載體上殘留的碳化二亞胺；
步驟3、準(zhǔn)確稱取10g的復(fù)合脫毛酶溶于1000ml的pH值為6.5的、離子強(qiáng)度為0.3mol/L的緩沖液中，配制成復(fù)合脫毛酶溶液，然后于5°C、1500r/min下離心15min，收集上層清液；
步驟4、將步驟2的多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球加入到200ml的復(fù)合酶溶液中，于15°C水浴中振蕩反應(yīng)60min，過濾并用去離子水洗去載體上殘留的復(fù)合酶，即得到以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶。
上述制得的以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶具有如下性質(zhì):
(1)外觀:米白色粉末；
(2)pH 值:5.0-7.5 ；
(3)干燥失重8%；
(4)酶活力:20000u/g；
(5)酶活殘留率:多99%；
(6)砷含量:0.001% ；
(7)重金屬含量:0.001%。
為了考察本發(fā)明所制備的固定化復(fù)合脫毛酶的酶固載量及活力保持的情況，本發(fā)明選取以上方法制備的以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶，并分別依據(jù)固定化酶活力的測(cè)定方法(陳青，張小薇，林美，等.響應(yīng)面法優(yōu)化海藻酸鈉固定α —淀粉酶的研究[J].廣州化工，2015，(6).中國(guó)人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).QB/T1803-1993[S],工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法，1993.)進(jìn)行了酶固載量和活力保持的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果是，以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶制劑酶的固定化效率彡67.48%，酶活力回收率彡57.93%。 其次，本發(fā)明還考察了 pH、環(huán)境溫度對(duì)制備的以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶活力的影響程度。在考察pH對(duì)以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶活力的影響時(shí)，于40°C條件下，將以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶與自由酶分別置于pH值為6.0-9.0的緩沖液中保溫lOmin后測(cè)定其酶活力，繼而得到了 pH值對(duì)以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶和自由酶活力的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可見，以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶在考察pH值范圍內(nèi)較自由酶均表現(xiàn)出了更高的相對(duì)活力，復(fù)合酶經(jīng)本發(fā)明方法固定后對(duì)pH的敏感性降低，可在更寬的pH范圍內(nèi)發(fā)揮較高的催化活力。
在考察環(huán)境溫度對(duì)以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶活力的影響時(shí)，將以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶與自由酶置于5-75°C下，pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液中保溫lOmin后測(cè)定其酶活力，繼而得到了溫度對(duì)以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶和自由酶活力的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可見，以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶在所考察的溫度范圍內(nèi)較自由酶均表現(xiàn)出更高的相對(duì)活力，復(fù)合酶經(jīng)本發(fā)明方法固定后對(duì)溫度的敏感性降低，并可在更廣泛的溫度范圍內(nèi)發(fā)揮較高的催化活力。
最后，本發(fā)明還考察了制備的以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的應(yīng)用效果。將使用該以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶制劑脫毛所得裸皮，經(jīng)1.0%的硫化鈉和0.7%的液堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的氫氧化鈉溶液)補(bǔ)充脫毛，其后按常規(guī)工藝制得成革，使用以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶脫毛后的裸皮拍照?qǐng)D，如圖3。同時(shí)，采用體視顯微鏡觀察成革樣品的粒面，結(jié)果見圖4。由圖3可見，采用以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶脫毛后的黃牛皮皮面潔白，粒面毛孔清晰，幾乎只存在少量短小絨毛和新生小毛。由圖4可見，采用以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶加工得到的黃牛鞋面革，粒面平整、光滑，毛孔較完整。因此以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶不同于常規(guī)生物酶，它未對(duì)加工得到的皮革質(zhì)量帶來(lái)十分顯著的負(fù)面影響，具有高度安全性，工藝及成革質(zhì)量穩(wěn)定性高，具有溫和脫毛的能力。
綜上所述，本發(fā)明所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)楣潭ɑ赣幂d體，該載體親水性好，且有較高的機(jī)械強(qiáng)度，空隙多，多孔性賦予了微球?qū)γ赣泻芎玫奈锢砦叫阅埽軌蛴行?shí)現(xiàn)酶的固定化，提升酶的固載量和活力，并且采用所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶進(jìn)行脫毛處理后的裸皮皮面潔白，粒面毛孔清晰，脫毛完全，并且該脫毛過程簡(jiǎn)單易操作，實(shí)用性高。而且所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法工藝簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，適合大批量化生產(chǎn)使用。
以上所記載，僅為利用本創(chuàng)作技術(shù)內(nèi)容的實(shí)施例，任何熟悉本項(xiàng)技藝者運(yùn)用本創(chuàng)作所做的修飾、變化，皆屬本創(chuàng)作主張的專利范圍，而不限于實(shí)施例所揭示者。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶，其特征在于，具有如下性質(zhì): (1)外觀:米白色粉末；(2)pH 值:5.0-7.5 ； (3)干燥失重8%； (4)酶活力:20000u/g； (5)酶活殘留率:多99%； (6)砷含量:0.001% ； (7)重金屬含量:0.001%。2.以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1、制備多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球； 步驟2、將100重量份多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球室溫下浸泡于1%的高碘酸溶液中60-240min，充分氧化后，過濾，洗滌，浸泡于100ml蒸餾水中，再加入10-15重量份1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺，并在20-30°C水浴中振蕩反應(yīng)60-120min，過濾并用去離子水洗去載體上殘留的碳化二亞胺； 步驟3、準(zhǔn)確稱取10g復(fù)合酶溶于1000 ml pH值為5.0-8.0的、離子強(qiáng)度為0.l-0.5mol/L的緩沖液中，配制成復(fù)合脫毛酶溶液，然后于5°C、1500r/min下離心15min，收集上層清液； 步驟4、將步驟2的多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球加入到復(fù)合脫毛酶溶液中，使酶與多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球質(zhì)量比為1:1，于15-40°C水浴中振蕩反應(yīng)30-90min，過濾并用去離子水洗去載體上殘留的復(fù)合脫毛酶，即得到以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法，其特征在于:步驟3中所述復(fù)合脫毛酶為每100重量份復(fù)合脫毛酶中包含50-65重量份的中性蛋白酶、10-15重量份的α淀粉酶、5_10重量份糖化酶、10-15重量份的胰酶、5-8重量份的脂肪酶、2- 5重量份的彈性蛋白酶。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法，其特征在于，步驟1包括如下步驟: 步驟①、在90°C條件下將100重量份的聚乙烯醇溶于蒸餾水中制備聚乙烯醇溶液，所述聚乙稀醇與蒸饋水的比例為lg:20ml ;步驟②、在40-50°C，轉(zhuǎn)速200r/min，攪拌時(shí)間60min的條件下將100重量份的羧甲基纖維素溶于溶劑中制備羧甲基纖維素溶液，所述溶劑可為氫氧化鈉溶液、甲基嗎啉溶液、尿素溶液或氨水中的至少一種，所述羧甲基纖維素與溶劑的比例為lg:20ml ;步驟③、將步驟②所得的羧甲基纖維素溶液溶于油相中，所述羧甲基纖維素溶液與油相的體積比為1:1，加入10-20重量份的乳化劑，在40-60°C、轉(zhuǎn)速600r/min的條件下，充分乳化90min后，以5ml/min的速度加入步驟①準(zhǔn)備好的聚乙稀醇溶液，持續(xù)攪拌120min后，鹽酸調(diào)節(jié)pH至3_5，保持轉(zhuǎn)速不變，攪拌30min ;步驟④、加入3-10重量份交聯(lián)劑，在40-60°C、轉(zhuǎn)速600r/min的條件下，攪拌180min ;步驟⑤、加入去離子水，去離子水作為固化劑，羧甲基纖維素溶液與去離子水的體積比為1: 3，加完去離子水后降低轉(zhuǎn)速150r/min，繼續(xù)攪拌10_30min ;步驟⑥、分液除去上層油脂，下層抽濾，依次用蒸饋水、丙酮、乙醇洗滌就可獲得多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶的制備方法，其特征在于:步驟③中的油相可為蓖麻油、石蠟橄欖油中的至少一種；步驟③中的乳化劑可為乳化劑可為司班80、司班20、吐溫20、吐溫80中的至少一種；步驟④中的交聯(lián)劑為戊二醛。
【專利摘要】本發(fā)明涉及制革化學(xué)與工程技術(shù)領(lǐng)域，提供一種以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶及其制備方法，所述以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)楣潭ɑ赣幂d體，該載體親水性好，且有較高的機(jī)械強(qiáng)度，空隙多，多孔性賦予了微球?qū)γ赣泻芎玫奈锢砦叫阅埽軌蛴行?shí)現(xiàn)酶的固定化，提升酶的固載量和活力，且具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，將以多孔羧甲基纖維素-聚乙烯醇微球?yàn)檩d體的固定化復(fù)合脫毛酶用于生皮脫毛和分散膠原纖維，生產(chǎn)條件溫和，對(duì)皮膠原水解過程和膠原纖維的分離松散程度的可控性提高，可以避免生產(chǎn)中產(chǎn)品質(zhì)量的波動(dòng)。
【IPC分類】C12N11/12, C12N11/08
【公開號(hào)】CN105400768
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510347968
【發(fā)明人】但衛(wèi)華, 吳美莉, 張玉紅, 溫會(huì)濤, 梁永賢, 吳渝玉, 楊義清
【申請(qǐng)人】興業(yè)皮革科技股份有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年6月23日