一種重組表達(dá)人谷氨酸脫羧酶的畢赤酵母基因工程菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)人谷氨酸脫羧酶的畢赤酵母基因工程菌，屬于基因工程 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酸脫駿酶（glutamic acid decarboxylase，GAD，EC4. I. 1. 15)在生物體內(nèi)廣 泛存在，其催化谷氨酸生成y -氨基丁酸（y -aminobutyric acid，GABA)，而GABA是哺乳 動物體內(nèi)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。在對自身免疫性疾病以及糖尿病研究中，特別是I 型糖尿病，GAD、GABA 以及谷氨酸脫羧酶抗體（glutamic acid decarboxylase antibody， GAD-Ab)，等的水平作為病理分析、疾病診斷、免疫治療的重要參數(shù)，歷來備受研究者關(guān)注。
[0003] GAD存在兩種異構(gòu)體形式：分子量為65, 000的GAD65和分子量為67, 000的GAD 67， 兩者分別由不同染色體上的非等位基因編碼。GAD65基因位于第10染色體短臂（p) 11. 23區(qū) 段，GAD67基因位于第2染色體長臂（q)31區(qū)段。它們的氨基酸同源性占60-70%，主要區(qū)別 在1-95和325-355位氨基酸序列。70-90%的I型糖尿病患者血清中可檢測出GAD 65抗體， 15-25%的I型糖尿病患者有GAD67抗體，說明I型糖尿病患者體內(nèi)GAD自身抗體主要是針 對GADjJt原的。
[0004] 隨著人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病在我國有著越來越高的發(fā)病率。減 少糖尿病并發(fā)癥成為一個(gè)棘手的問題。目前越來越多的人把目光轉(zhuǎn)移到了利用基因工程手 段獲取GAD抗原。此種方法不僅原料消耗小，成本低，純度高，且克服了由于6六0 65蛋白在胰 腺組織中含量極低，制備困難，以及人源組織不易獲得等缺點(diǎn)，因而具有廣泛的臨床應(yīng)用前 景。
[0005] 目前，雖然已有少數(shù)報(bào)道將哺乳動物來源的GAD65成功表達(dá)于微生物中，但存在表 達(dá)量低、質(zhì)粒表達(dá)量不穩(wěn)定、酶活低、形成包涵體、胞內(nèi)分泌等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)人谷氨酸脫羧酶（GAD)的畢赤酵母 基因工程菌，實(shí)現(xiàn)了人谷氨酸脫羧酶的活性表達(dá)、高效表達(dá)。本發(fā)明采用畢赤酵母為宿主和 基因組整合性質(zhì)粒PPICZa為表達(dá)載體，成功的把人源GAD 65S因重組到畢赤酵母基因組上 且形成產(chǎn)物分泌到胞外，這不僅克服了質(zhì)粒表達(dá)的不穩(wěn)定性、表達(dá)量低等問題，而且也簡化 了形成包涵體或胞內(nèi)分泌所帶來的工作量。所篩選得到重組菌株，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)能過量表達(dá) GAD65并分泌到胞外，其具有免疫原性。
[0007] 本發(fā)明提供了一種高效活性表達(dá)人的谷氨酸脫羧酶的方法，是構(gòu)建以畢赤酵母為 宿主整合表達(dá)核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述的谷氨酸脫羧酶的重組菌，然后以該重組菌 發(fā)酵生產(chǎn)人的谷氨酸脫羧酶。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將SEQ ID NO: 1所述的谷氨酸脫羧酶基 因〇六065連接到表達(dá)載體pPICZ α上，得到重組質(zhì)粒pPICZ a -hGAD 65，然后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母 X-33菌株，使GAD65*編碼序列插入酵母基因組中，篩選得到重組菌。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵是將重組菌活化后接種于BMGY培養(yǎng)基培 養(yǎng)20h，然后靜置棄上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體并加入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵具體是：將重組菌單菌落接種于生長培養(yǎng) 基BMGY中，30°C，200r/min培養(yǎng)20h ;將菌液，室溫靜置lh，棄掉上清液，用30mL BMMY培養(yǎng) 基重新懸浮菌體，加入100%甲醇至終濃度為1% (v/v)，30°C，200r/min培養(yǎng)，每隔24h補(bǔ) 加100%甲醇至終濃度為1%(￥八）進(jìn)行誘導(dǎo)；誘導(dǎo)4811后，1200(^/111丨11離心5111丨11，保留上 清液，即為含有谷氨酸脫羧酶的液體。
[0011] 本發(fā)明還提供一種畢赤酵母基因工程菌，所述基因工程菌以畢赤酵母為宿主表達(dá) 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所述的谷氨酸脫羧酶。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主是畢赤酵母X-33菌株。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌的構(gòu)建：將SEQ ID NO: 1所述的谷氨 酸脫羧酶基因6六065連接到表達(dá)載體pPICZ α上，得到重組質(zhì)粒pPICZ a -hGAD 65，然后電轉(zhuǎn) 入畢赤酵母X-33菌株，使GAD65*編碼序列插入酵母基因組中，篩選得到重組菌。
[0014] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述基因工程菌生產(chǎn)的谷氨酸脫羧酶，以及得到的谷氨酸脫羧 酶在制備藥物方面的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了人的谷氨酸脫羧酶的活性表達(dá)、高效表達(dá)，本發(fā)明使用畢赤酵母作 為宿主，得到的基因工程菌經(jīng)搖瓶發(fā)酵、Tricine-SDS-PAGE和Western Blot鑒定，證實(shí)人 源谷氨酸脫羧酶（GAD65)實(shí)現(xiàn)了誘導(dǎo)表達(dá)。最后，通過對發(fā)酵上清液進(jìn)行分離純化得到融合 蛋白，經(jīng)過蛋白濃度測定，融合蛋白hGAD 65*度達(dá)到2. 36g/L。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :表達(dá)載體菌體PCR驗(yàn)證；1為空載體PCR產(chǎn)物；2為含有pPICZ a -hAGAD6^ 粒的DH5 α重組子PCR產(chǎn)物；
[0018] 圖2 :表達(dá)載體整合酵母基因組驗(yàn)證；
[0019] 圖3 :重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的檢測；
[0020] 圖4 :Western Blot鑒定融合蛋白hGAD65(l :GAD+病人血清為一抗；2 :GAD65單克 隆抗體一抗）。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 低鹽LB培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10g，NaC15g，酵母粉5g ;
[0022] ΥΗ)培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g ;
[0023] YPDS培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，山梨醇182g ;
[0024] BMGY 培養(yǎng)基（g/L):酵母粉 10g，胰蛋白胨 20g，甘油 20g，（NH4)2SO4IOg, YNB3. 4g， ImoL/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液（ρΗ6· 0) 100mL，生物素 4 X 10 5g ;
[0025] BMMY 培養(yǎng)基（g/L):酵母粉 10g，胰蛋白胨 20g，（NH4)2SO4IOg, YNB3. 4g，ImoL/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液（ρΗ6· 0) 100mL，生物素 4 X 10 5g。
[0026] 實(shí)施例1 :重組菌的構(gòu)建
[0027] (1)重組質(zhì)粒 pMD19-T-GAD65的構(gòu)建
[0028] 將核苷酸如SEQ ID NO: 1的GAD酶基因連接到pMD19-T質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，得到重組質(zhì)粒pMD19-T-GAD65。抽提pMD19-T-GAD 6#P pPICZa質(zhì)粒，然 后以XhoI和NotI分別雙酶pMD19-T-GAD65(合成的GAD65基因克隆至pMD19-T載體上）和 pPICZa質(zhì)粒4h，0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析。利用割膠回收試劑盒回收目的片段，16°C連 接4h后，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布到含終濃度為25 μ g/ mL zeocin的低鹽LB平板上，37°C培養(yǎng)24h后，挑選若干平板上生長出來的菌落，接種于2mL 含終濃度為25 μ g/mL zeocin的低鹽LB液體試管中培養(yǎng)，然后以5' AOXl和3' AOXl為引物， 進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果陽性克隆擴(kuò)增出2346bp片段，而以空載體pPICZ a作為對照擴(kuò)增 出588b片段（如圖1)，與理論相符，說明目的基因已經(jīng)連接到pPICZa載體上，經(jīng)測序，表 達(dá)載體的閱讀框正確。得到重組質(zhì)粒pPICZ a -hGAD65。
[0029] (2)重組畢赤酵母的構(gòu)建
[0030] 以SacI線性化的表達(dá)載體pPICZ a -hGAD65電轉(zhuǎn)化X-33畢赤酵母，涂布100 μ g/ mL zeocin的YH)抗性平板上進(jìn)行后培養(yǎng)，將長出來的單菌落重新劃線于此濃度抗性平板 上，挑選長勢好的單菌落作為進(jìn)一步驗(yàn)證其酵母基因組中是否整合了表達(dá)載體，以上述株 菌的基因組為模板，5' AOXl和3' AOXl為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，菌株擴(kuò)增出 2. 2kb (基因組上的醇氧化酶基因）和2346bp (表達(dá)載體上的目的片段），而對照（整合了 空載體pPICZ a的重組畢赤酵母）擴(kuò)增出2. 2kb和588bp (空載體上的目的片段），表明此 株菌可初步認(rèn)為是成功整合了表達(dá)載體的重組畢赤酵母。將驗(yàn)證正確的菌株保種，送測序， 測序結(jié)果表明，GAD 65全編碼序列正向插入酵母基因組中，閱讀框的正確性。
[0031] 其中酵母感受態(tài)的制備方法如下：
[0032] (1)從新鮮YPD平板上挑取X-33畢赤酵母菌落于25mL YH)液體培養(yǎng)基中，30°C， 200r/min 培養(yǎng) 20h ;
[0033] (2)將0· 5mL上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到25mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 °C，200r/min培養(yǎng) 8h (大約 0D600 = L 3-1. 5);
[0034] (3)吸取ImL上述菌液于I. 5mL無菌的EP管中，4000r/min離心2min，收集菌體， 用I. 5mL預(yù)冷的無菌水，吹打懸浮細(xì)胞；
[0035] (4) 4000r/min離心2min，收集菌體，用ImL預(yù)冷的無菌水重新懸浮細(xì)胞；
[0036] (5) 4000r/min離心2min，收集菌體，用I. 5mL預(yù)冷的ImoL/L山梨醇懸浮細(xì)胞；
[0037] (6)4000r/min離心2min，收集菌體，用100 μ L預(yù)冷的ImoL/L山梨醇混勻細(xì)胞， 5min后方可使用。
[0038] 電穿孔轉(zhuǎn)化法如下：
[0039] (1)提前預(yù)熱電穿孔儀；
[0040] (2)取80 μ L酵母感受態(tài)細(xì)胞與20 μ L線性化的表達(dá)載體，輕輕混勻，冰浴5min ; 后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的〇. 2cm電擊杯中；
[0041] (3)將電擊杯外水汽徹底擦干凈，放入電擊室；
[0042] (4)按電轉(zhuǎn)參數(shù)：1.51^，25 4卩，200,51118進(jìn)行電擊；
[0043] (5)電擊后立即加入ImL預(yù)冷的ImoL/L山梨醇于電擊杯中，輕輕吹打后，將內(nèi)容物 全部轉(zhuǎn)入無菌的I. 5mL EP管中，于30°C復(fù)活培養(yǎng)Ih ;
[0044] (6) 4000r/min離心5min，去除750 μ L上清液，將剩余的菌液涂布到含有100 μ g/ mL zeocin 的 YPDS 平板上，30°C培養(yǎng) 3-5d。
[0045] 實(shí)施例2 :重組菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶GAD65
[0046] 融合蛋白hGAD65的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物的鑒定
[0047] (1)誘導(dǎo)表達(dá)
[0048] 抽提測序正確的重組質(zhì)粒pPICZ a -hGAD65R化到畢赤酵母X-33,得到基因工程表 達(dá)菌。
[0049] (a)將選定的重組畢赤酵母單菌落接種于50mL生長培養(yǎng)基BMGY/500mL三角瓶中， 30°C，200r/min 培養(yǎng) 20h ;
[0050] (b)將上述BMGY生長培養(yǎng)基中的菌液，室溫靜置lh，棄掉上清液，用30mL BMMY培 養(yǎng)基重新懸浮菌體，加入100%甲醇至終濃度為1%(￥八），30°(：，20(^/1^11培養(yǎng)，每隔2411 補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為1% (v/v)進(jìn)行誘導(dǎo)；
[0051] (c)甲醇誘導(dǎo) 48h 后，12000r/min 離心 5min，保留上清液，進(jìn)行 Tricine-SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳（圖3)。
[0052] (2)表達(dá)產(chǎn)物 hGAD6^ Tricine-SDS-PAGE 分析鑒定
[0053] 按照Protein Assay Kit Bradford蛋白質(zhì)定