量檢測試劑盒說明，測定上清液中蛋 白的相對分子量并對蛋白進行粗略定量分析。
[0054] Tricine-SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳
[0055] (1)試劑配制：
[0056] 30% T，3. 3% C母液：稱取29. Og聚丙烯酰胺和1.0 g雙丙烯酰胺，重蒸水溶解并 定容至100mL，貯存于棕色瓶中，4°C保存；
[0057] 10%過硫酸銨：稱取LOg過硫酸銨，用超純水溶解并定容至10mL，4°C保存1-2 周；
[0058] I. 5M Tris Buffer，pH8· 8 分離膠用（室溫保存）：18· Hg Tris 加濃 HCL 調(diào)至 pH8. 8,IOOmL ;
[0059] 0· 5M Tris Buffer，ρΗ6· 8,積層膠用（室溫）：6. 06g Tris 加濃 HCL 調(diào)至 ρΗ6· 8， IOOmL ；
[0060] 10%過硫酸銨：稱取LOg過硫酸銨，用超純水溶解并定容至10mL，4°C保存1-2 周；
[0061] 10% SDS(W/V) :10g的SDS粉末溶解在水里，定容到100mL。
[0062] 染色液：稱取1.0 g考馬斯亮藍R250、68mL乙酸和500mL甲醇，超純水定容至IL ;
[0063] 脫色液：量取37. 5mL乙酸，25mL甲醇，用超純水定容至500mL ;
[0064] 電泳緩沖液：稱取3. 028g Tris Base，14. 412g甘氨酸，I. 00g SDS，用超純水定容 至1L。
[0065] (2)操作步驟：
[0066] ①樣品處理：取30 μ L蛋白樣品液（發(fā)酵上清液）加入30 μ L2X緩沖液（1 :1)， 沸水浴5min，-20°C保存，備用；
[0067] ②按順序分別配制分離膠、積層膠：取20mL干凈小燒杯1只，根據(jù)各種膠的濃度， 按表1依次加入各種試劑，輕輕混勾，避免產(chǎn)生氣泡，最后加入10 %過硫酸銨和TEMED，再輕 輕混勻；
[0068] ③將混勻的凝膠液迅速、平穩(wěn)地注入兩層玻璃板中，留出其余膠所需的空間，然后 盡快在液面上小心注入一層水，以隔絕空氣（注意盡量避免擾動膠液面），靜置40-60min， 每層膠完全聚合后，吸凈上層液，再灌入另外一種膠，其中最后一層膠灌至玻璃板頂端，然 后小心插入梳子，靜置30-45min，待膠聚合；
[0069] ④將膠板放入電泳槽中，向內(nèi)層加電泳緩沖液，直至沒過內(nèi)層玻璃板，小心緩慢地 取出梳子；
[0070] ⑤取一定體積處理好的樣品加入到樣品孔中，點樣后向外層加入電泳緩沖液至玻 璃板高度一半以上；
[0071] ⑥電泳：穩(wěn)壓120V;
[0072] ⑦固定：將凝膠從玻璃板上取下，在固定液中固定30_40min ;
[0073] ⑧染色和脫色：傾出固定液，用去離子水漂洗1-2次，加入染色液染色40_60min ; 傾出染色液，用去離子水漂洗1-2次，加入脫色液脫色，期間更換脫色液3-4次。凝膠可在 脫色液中保存一定時間。結(jié)果如圖3所示。
[0074] 表1Tricine-SDS-PAGE蛋白凝膠膠配方
[0076] (3)計算樣品的相對迀移率（Rf)及分子量（MV):
[0077] (a)蛋白帶相對迀移率的計算：根據(jù)weber公式
[0078] Rf = Sp/G^Gi/S
[0079] Rf :相對迀移率。
[0080] PS :樣品迀移距離，樣品染色帶中心到分離膠上緣的距離。
[0081] S :指示劑迀移距離，指示劑色帶中心到分離膠上緣的距離。
[0082] G1:染色前凝膠長度，染色前凝膠下緣到分離膠上緣的距離。
[0083] G2:脫色后凝膠長度，染色后凝膠下緣到分離膠上緣的距離。
[0084] (b)表達產(chǎn)物分子量的估算：
[0085] 通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量及其迀移率，建立IgMV與Rf之間的回歸方程，根據(jù)重組蛋白 的Rf值計算分子量。
[0086] 對篩選出的重組畢赤酵母，經(jīng)過搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后，將含等量總蛋白濃度的上 清液進行Tricine-SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果在65KD附近均出現(xiàn)目標(biāo)條帶，與預(yù)測大小相 符，而對照：X-33 (原始酵母）、S0 (以空載體pPICZ α進行電轉(zhuǎn)化獲得的重組畢赤酵母）均 未出現(xiàn)（如圖3)，初步認為人的谷氨酸脫羧酶GAD65獲得表達。
[0087] 實施例3 :重組菌發(fā)酵的谷氨酸脫羧酶GAD65的活性檢測
[0088] 采用Western Blot鑒定融合蛋白hGAD65〇
[0089] (1)以GAD抗體陽性的糖尿病病人血清為一抗：
[0090] ① Tricine-SDS-PAGE :取搖瓶水平蛋白樣品200 μ 1沉樣進行 Tricine-SDS-PAGE ；
[0091] ②轉(zhuǎn)印：取一張與凝膠大小相同的硝酸纖維素濾膜（NC)和6塊3_的濾紙浸泡于 電轉(zhuǎn)緩沖液中l(wèi)〇_15min。電泳結(jié)束后，取下凝膠，切去積層膠做標(biāo)記，用電轉(zhuǎn)緩沖液漂洗并 平衡20min。按照以下順序安裝：陽極-海綿-3張濾紙-NC膜-凝膠-3張濾紙-海綿-陰 極。每放置一層，要去除各層之間的氣泡，以免影響轉(zhuǎn)移效果。用塑料支架夾緊固定上述各 層，置于電泳轉(zhuǎn)移槽中并接通電源，采用恒流方式〇. SmA/cm2轉(zhuǎn)移1小時；然后，將NC濾膜 取出，放置干凈的濾紙上，室溫干燥30-60分鐘。
[0092] ③抗原抗體反應(yīng)：將NC膜浸入適量的封閉液中，4°C放置過夜；以抗體稀釋液清 洗NC膜2次后將其置入一塑料袋中，然后，用抗體稀釋液稀釋病人血清抗體至I :100-1 : 1000,封閉塑料袋，37°C放置2小時。剪開塑料袋，以PBS清洗NC膜2次，加入1:200-1 :1000 倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，37°C放置2小時；
[0093] ④顯色：按照DAB顯色試劑盒說明書，在干凈的平皿中加入IOml蒸餾水，取A、B、 C溶液各5滴，混勻后加入NC膜，約3分鐘后顯色；
[0094] (2)以人源GAD單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品為一抗：
[0095] 方法同（1)。
[0096] -抗為GAD(+)病人血清：由圖4可見，用于Western Blot檢測的硝酸纖維素膜經(jīng) 底物顯色后有一條小于66. 4KD的單一條帶，其位置與重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的特異 性條帶位置一致。
[0097] -抗為GAD65單克隆抗體：如圖4,硝酸纖維素膜經(jīng)底物顯色后有一條小于66. 4KD 的單一條帶，其位置與重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的特異性條帶位置一致。
[0098] 以上數(shù)據(jù)說明，采用本發(fā)明方法實現(xiàn)了人的GAD在畢赤酵母中的活性表達。
[0099] 實施例4 :產(chǎn)物蛋白的純化與蛋白濃度的測定
[0100] ⑴產(chǎn)物蛋白的純化
[0101] 取實施例2得到的誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，經(jīng)離心取上清液進行蛋白純化，收集洗脫液并 取20 μ 1進行電泳鑒定。
[0102] 純化具體步驟：
[0103] (a)去掉鎳柱上層管中儲存液（20%的乙醇），IOml平衡液平衡鎳柱；
[0104] (b)待平衡液流盡后，向鎳柱上層管中加入樣品（通過20μπι濾膜），讓其自然滴 下；液體流盡后，加入IOml的平衡液，清洗雜蛋白，不需要收集
[0105] (c)洗雜結(jié)束后，先用3ml的含200mM咪唑的洗脫液洗脫收集；
[0106] (d)進行SDS-PAGE，檢測洗脫目的蛋白。
[0107] (e)使用結(jié)束的鎳柱，再次使用IOml的平衡進行平衡，流盡后，再用20 %的乙醇保 存。
[0108] 其中，平衡液：20mM 的磷酸鹽緩沖液（NaH2P04、Na2HPO4)，500mM NaCl，20mM 咪唑， ρΗ7· 4 ;洗脫液：20mM 的磷酸鹽緩沖液（NaH2P04、Na2HPO4)，500mM NaCl，200mM 咪唑，ρΗ7· 4。
[0109] 純化產(chǎn)物僅在大小約為66. 4KD處有一條蛋白質(zhì)條帶，并且其位置與誘導(dǎo)表達產(chǎn) 物中的融合蛋白位置相一致。
[0110] ⑵蛋白濃度的測定
[0111] Bradford 法定量測 hGAD65:
[0112] 取10支試管，1支加待測樣品，其余9支試管按順序分別加入：0、2. 5、5. 0、7. 5、 10. 0、12. 5、15. 0、17. 5、20. 0 μ L標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（BSA)，每個樣品準(zhǔn)備3份。
[0113] (a)用0· 9% NaCl溶液補充溶液總體積到0· lmL。
[0114] (b)各試管中分別加入ImL Bradford工作液，2min內(nèi)加完試劑，用比色皿在分光 光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值（A595)。
[0115] (c)測出A值以后，以A595值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白（BSA)含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線。
[0116] 400ml酵母培養(yǎng)液表達的上清液中蛋白經(jīng)鎳柱純化后共獲得20ml洗脫液。以 BSA為標(biāo)識物，用Bradford法測蛋白IiGAD65*度為46. Omg/ml，則每升培養(yǎng)液可得蛋白= 46. 0X20 + 400*1000 = 2. 36g/L。
[0117] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種高效活性表達人的谷氨酸脫羧酶的方法，其特征在于，所述方法是構(gòu)建以畢赤 酵母為宿主表達核苷酸序列如SEQIDNO: 1所述的谷氨酸脫羧酶的重組菌，然后以該重組 菌發(fā)酵生產(chǎn)人的谷氨酸脫羧酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是將SEQIDNO: 1所述的谷氨酸 脫羧酶基因6六065連接到表達載體pPICZα上，得到重組質(zhì)粒pPICZa-hGAD65，然后電轉(zhuǎn)入 畢赤酵母X-33菌株，使GAD65*編碼序列插入酵母基因組中，篩選得到重組菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵是將重組菌活化后接種于BMGY 培養(yǎng)基培養(yǎng)20h，然后靜置棄上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體并加入甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。4. 一種畢赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以畢赤酵母為宿主表達核 苷酸序列如SEQIDNO: 1所述的谷氨酸脫羧酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的構(gòu)建：將 SEQIDN0:1所述的谷氨酸脫羧酶基因6六065連接到表達載體pPICZa上，得到重組質(zhì)粒 pPICZa-hGAD65，然后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33菌株，使GAD65*編碼序列插入酵母基因組中，篩 選得到重組菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主是畢赤酵母X-33菌株。7. 權(quán)利要求4-6任一所述基因工程菌生產(chǎn)的谷氨酸脫羧酶。8. 權(quán)利要求7所述谷氨酸脫羧酶在制備藥物方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組表達人谷氨酸脫羧酶的畢赤酵母基因工程菌，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將人谷氨酸脫羧酶基因GAD65與載體pPICZα連接構(gòu)建表達載體pPICZα-hGAD65，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33中，獲得過量表達人谷氨酸脫羧酶(GAD65)的重組菌株。本發(fā)明的重組菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵、Tricine-SDS-PAGE和Western？Blot鑒定，證實人源谷氨酸脫羧酶(GAD65)實現(xiàn)了誘導(dǎo)表達，通過對發(fā)酵上清液進行分離純化得到融合蛋白，經(jīng)過蛋白濃度測定，蛋白hGAD65濃度達到2.36g/L。
【IPC分類】C12N15/81, A61P3/10, C12R1/84, C12N1/19, C12N9/88, A61K38/51
【公開號】CN105400813
【申請?zhí)枴緾N201510997621
【發(fā)明人】劉立明, 羅秋玲, 劉佳
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月28日