乳酸誘導(dǎo)上皮樣細(xì)胞分化的b淋巴母細(xì)胞模型及其構(gòu)建與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種永生化上皮樣細(xì)胞分化的B 淋巴母細(xì)胞模型，該細(xì)胞模型可用于B淋巴瘤的基礎(chǔ)研究，特別是酸性微環(huán)境下B淋巴瘤惡 化和轉(zhuǎn)移機(jī)制。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)臨床行為的不同，B細(xì)胞淋巴瘤分為惰性淋巴瘤和侵襲性淋巴瘤。惰性淋巴 瘤通常發(fā)展緩慢，可保持多年疾病穩(wěn)定及長(zhǎng)期生存，侵襲性淋巴瘤惡性程度較高，通常需要 較強(qiáng)烈的治療方法。惰性淋巴瘤可以向侵襲性淋巴瘤演變，但機(jī)制尚不清楚。腫瘤細(xì)胞通 過高效率的糖酵解生成的乳酸，形成一個(gè)不適合正常細(xì)胞生存的細(xì)胞外酸性微環(huán)境，促進(jìn) 腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。EB病毒通過與B淋巴細(xì)胞表面上的EB病毒受體CD21結(jié)合， 感染的B淋巴細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎郎牧馨湍讣?xì)胞（LCL)。
[0003] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN101374944A公開了一種用于獲得永生化抗體分泌細(xì)胞的方法， 提供用于永生化可分泌一種或多種特定同種型抗體的細(xì)胞的新型方法；利用該發(fā)明的方法 獲得的多克隆、寡克隆和單克隆細(xì)胞種群可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，基于它們分泌的抗體的功 能和/或結(jié)合活性（如針對(duì)醫(yī)學(xué)感興趣的人類或病毒起源的抗原）進(jìn)行篩選；利用該發(fā)明 的方法，已通過EB病毒將可分泌結(jié)合人類巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒或HSP60蛋白的抗體 的人類B細(xì)胞有效地永生化。雖然EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)制備永生化的B淋巴母細(xì)胞是現(xiàn)有技 術(shù)，但是關(guān)于一種永生化上皮樣細(xì)胞分化的B淋巴母細(xì)胞目前還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是通過EB病毒轉(zhuǎn)化正常的B細(xì)胞為永生化的LCL，對(duì)永生化的B細(xì) 胞施加乳酸誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得上皮樣細(xì)胞分化、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞，該細(xì)胞迀移能力 增強(qiáng)，為研究B細(xì)胞淋巴瘤的惡性演變提供研究工具。
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供一種永生化上皮樣細(xì)胞分化的B淋巴母細(xì)胞的制備方 法，該方法主要包括以下步驟：
[0006] ㈧利用淋巴細(xì)胞分離液和磁珠分選獲取B淋巴細(xì)胞，加入淋巴細(xì)胞激活物促進(jìn)B 細(xì)胞增殖，提高淋巴細(xì)胞的數(shù)量，再運(yùn)用EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得永生化的淋巴母細(xì)胞（LCL);
[0007] (B)通過給步驟（A)中制備的LCL施加乳酸壓力篩選，待懸浮生長(zhǎng)的LCL出現(xiàn)上皮 樣細(xì)胞分化、貼壁生長(zhǎng)時(shí)，去除上層懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，挑取單個(gè)克隆的細(xì)胞接種于96孔板， 繼而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得永生化上皮樣細(xì)胞分化的B淋巴母細(xì)胞。
[0008] 優(yōu)選的，所述的步驟（B)中乳酸濃度為10mM。
[0009] 優(yōu)選的，所述的步驟（A)中的淋巴細(xì)胞分離液是Ficoll-hypaque(葡聚糖一泛影 葡胺）混合物。Ficoll-hypaque (葡聚糖一泛影葡胺）密度梯度離心法目前是分離外周血 細(xì)胞主要的分離方法。另外一種分離方法是Percoll ( -種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮處理的硅膠 顆粒）。
[0010] 所述的步驟（A)中加入的淋巴細(xì)胞激活物是寡核苷酸序列CpG 2006 (序列為SEQ ID NO. I :TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)，通過激活B淋巴細(xì)胞TLR9,促進(jìn)B細(xì)胞增殖。所述 的淋巴細(xì)胞激活物還可以是促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IL-6等。
[0011] 所述的EBV是EB病毒的簡(jiǎn)稱。EB病毒感染B淋巴細(xì)胞后使得B淋巴細(xì)胞 可轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣?xì)胞，并能無(wú)限增殖。所述的EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)的參考文獻(xiàn)=Traggiai E. Immortalization of human B cells:analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 2012 ；901:161-70.
[0012] 優(yōu)選的，本發(fā)明的永生化上皮樣細(xì)胞分化的B淋巴母細(xì)胞的制備方法，具體包括 以下步驟：
[0013] 1.分離外周血中的B細(xì)胞：
[0014] 將采到的外周血使用Hank' s液/PBS液/無(wú)血清RPMI1640將血樣1 :1稀釋，從 冰箱中取出4°C避光保存的淋巴細(xì)胞分離液。室溫下2000rpm離心20min。將吸管輕輕穿 過血漿層至白膜層，沿離心管周緣吸出血漿層與分離液層界面間的白膜層細(xì)胞，置于新離 心管中。盡量少吸取分離液。加入RPMI1640,吹打均勻后取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞。將外周血單個(gè)核 細(xì)胞通過⑶20磁珠分選方法獲得B淋巴細(xì)胞。
[0015] 2. EB病毒顆粒的制備
[0016] 采用B95. 8細(xì)胞培養(yǎng)EB病毒：B95. 8細(xì)胞懸于10 %胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中， 調(diào)整細(xì)胞濃度至IX l〇6/ml。饑餓培養(yǎng)7天，使B95-8細(xì)胞充分釋放EB病毒顆粒。7天后 收集培養(yǎng)上清，獲得含病毒抗原的上清液。將所有上清液經(jīng)〇. 45 μ m微孔濾膜過濾，過濾后 的上清液采用高速離心取沉淀，將沉淀用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，凍存管分裝并密封，標(biāo)記 好放入-80°C低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0017] 3.利用EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞：
[0018] 將分離出的B淋巴細(xì)胞重懸在制備好的EB病毒液中，同時(shí)在37 °C下緩 慢震蕩90分鐘，用PBS將細(xì)胞洗一次，懸于10 %胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào) 整細(xì)胞濃度至lXl〇6/ml。加入終濃度為2mg/L CpG 2006(序列為SEQ ID NO. 1: TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)刺激B淋巴細(xì)胞增殖，將細(xì)胞懸液注入96孔微孔板中，0.1 ml/ 孔，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，此后每隔5~7天對(duì)半換液，2~3周內(nèi)觀察各孔的細(xì)胞增殖情況。 挑取接種于96孔板單個(gè)細(xì)胞克隆，繼而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得永生化的LCL。
[0019] 4.施加乳酸壓力篩選，獲得上皮樣細(xì)胞分化、貼壁生長(zhǎng)LCL :
[0020] 將獲得的LCL接種含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的96孔板，加入終濃度為 IOmM乳酸（即加入乳酸后乳酸在總?cè)芤褐械臐舛葹镮OmM)，在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 48小時(shí)后觀察各孔的細(xì)胞增殖情況，挑選出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)的微孔，去除懸浮的死細(xì)胞和未貼 壁細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞使用不含乳酸的10 %胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)加入 lOOU/ml的白介素-2促進(jìn)細(xì)胞增殖。1周后，重新加入終濃度為IOmM乳酸誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁生 長(zhǎng)，挑取細(xì)胞克隆接種于6孔板，繼而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得永生化上皮樣細(xì)胞分化的B淋巴 母細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明采用EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)將正常的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為永生化的淋巴母細(xì)胞，采 用乳酸將懸浮生長(zhǎng)的淋巴母細(xì)胞誘導(dǎo)形成上皮樣分化、可貼壁生長(zhǎng)的淋巴母細(xì)胞，所獲得 的細(xì)胞具有原有淋巴母細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原，同時(shí)能像上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞一樣分泌 大量的細(xì)胞外基質(zhì)（如膠原蛋白，基質(zhì)金屬蛋白酶等）。
[0022] 本發(fā)明的第二方面，提供采用上述制備方法制備得到的永生化上皮樣細(xì)胞分化的 B淋巴母細(xì)胞模型。
[0023] 本發(fā)明的第三方面，提供上述永生化上皮樣細(xì)胞分化的B淋巴母細(xì)胞模型在B細(xì) 胞淋巴瘤機(jī)制研究、藥物篩選或藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0025] 本發(fā)明獲得的上皮樣細(xì)胞分化的B淋巴母細(xì)胞模型具有原有淋巴母細(xì)胞的細(xì)胞 表面抗原，同時(shí)能像上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞一樣分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，該細(xì)胞迀移能 力增強(qiáng)，為研究B細(xì)胞淋巴瘤的惡性演變提供研究工具；該細(xì)胞模型可用于B淋巴瘤的基礎(chǔ) 研究，特別是酸性微環(huán)境下B淋巴瘤惡化和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究，以及B細(xì)胞淋巴瘤的藥物篩選或 評(píng)價(jià)。
【附圖說明】
[0026] 圖I. MTT法檢測(cè)不同濃度的乳酸對(duì)LCL增殖的影響。
[0027] 圖2.普通光鏡的形態(tài)學(xué)觀察，篩選后的LCL在不同濃度乳酸作用下形態(tài)學(xué)特征。 A :未受乳酸誘導(dǎo)的LCL呈圓球形，體積較正常B細(xì)胞大，胞質(zhì)豐富，呈細(xì)胞表面有突起，細(xì)胞 呈團(tuán)懸浮生長(zhǎng)。B :10mM乳酸誘導(dǎo)后細(xì)胞出現(xiàn)呈梭型或不規(guī)則型，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。C :60mM乳 酸作用，細(xì)胞裂解死亡。
[0028] 圖3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度乳酸作用下，LCL存在的自發(fā)性細(xì)胞凋亡。A :未受 乳酸誘導(dǎo)的LCL自發(fā)性細(xì)胞凋亡的比例為0. 5%左右。B :10mM乳酸誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡比例在 1%作用。C :60mM乳酸作用，細(xì)胞大量死亡，晚凋和早凋的比例超過80%。
[0029] 圖4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳酸誘導(dǎo)后LCL的細(xì)胞表面抗原分子。細(xì)胞表面抗原標(biāo)記， ⑶19和⑶45抗原分子為陽(yáng)性，⑶3、⑶4、⑶8、⑶16、⑶56抗原分子為陰性，LCL細(xì)胞為B系 來(lái)源。
[0030] 圖5.乳酸誘導(dǎo)后的LCL進(jìn)行核型分析。大部分LCL染色體正常，核型正常的LCL 將有助于獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞株。
[0031] 圖6. PCR檢測(cè)乳酸誘導(dǎo)后的LCL是否攜帶EB病毒核酸分子。乳酸誘導(dǎo)前后的LCL 經(jīng)PCR檢測(cè)，均攜帶有EB病毒EBNA-I基因序列。
[0032] 圖7. Western Blot檢測(cè)乳酸誘導(dǎo)LCL產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。不同時(shí)間乳酸誘導(dǎo)LCL， LCL可分泌膠原蛋白以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MPP)等細(xì)胞外基質(zhì)成分。
[0033] 圖8. Transwell檢測(cè)乳酸作用下LCL的細(xì)胞迀移能力。濃度為IOmM乳酸作用后 的LCL較未加乳酸作用的LCL迀移能力增強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 1.分離外周血中的B細(xì)胞：
[0037] 將采到的外周血使用Hank' s液/PBS液/無(wú)血清RPMI1640將血樣1 :1稀釋，從 冰箱中取出4°C避光保存的淋巴細(xì)胞分離液。室溫下2000rpm離心20min。將吸管輕輕穿 過血漿層至白膜層，沿離心管周緣吸出血漿層與分離液層界面間的白膜層細(xì)胞，置于新離 心管中。盡量少吸取分離液。加入RPMI1640,吹打均勻后取樣計(jì)數(shù)細(xì)胞。將外周血單個(gè)核 細(xì)胞通過⑶20磁珠分選方法獲得B淋巴細(xì)胞。
[0038] 2. EB病毒顆粒的制備
[0039] 采用B95. 8細(xì)胞培養(yǎng)EB病毒：B95. 8細(xì)胞懸于10 %胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基中， 調(diào)整細(xì)胞濃度至IX l〇6/ml。饑餓培養(yǎng)7天，使B95-8細(xì)胞充分釋放EB病毒顆粒。7天后 收集培養(yǎng)上清，獲得含病毒抗原的上清液。將所有上清液經(jīng)〇. 45 μ m微孔濾膜過濾，過濾后 的上清液采用高速離心取沉淀，將沉淀用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，