凍存管分裝并密封，標記 好放入-80°C低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0040] 3.利用EB病毒轉化技術轉化淋巴母細胞：
[0041] 將分離出的B淋巴細胞重懸在制備好的EB病毒液中，同時在37 °C下緩 慢震蕩90分鐘，用PBS將細胞洗一次，懸于10 %胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，調 整細胞濃度至lXl〇6/ml。加入終濃度為2mg/L CpG 2006(序列為SEQ ID NO. 1: TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)刺激B淋巴細胞增殖，將細胞懸液注入96孔微孔板中，0.1 ml/ 孔，置CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，此后每隔5~7天對半換液，2~3周內觀察各孔的細胞增殖情況。 挑取接種于96孔板單個細胞克隆，繼而進行擴大培養(yǎng)，獲得永生化的LCL。
[0042] 4.施加乳酸壓力篩選，獲得上皮樣細胞分化、貼壁生長LCL :
[0043] 將獲得的LCL接種含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基的96孔板，加入終濃度為 IOmM乳酸，在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時后觀察各孔的細胞增殖情況，挑選出現 貼壁生長的微孔，去除懸浮的死細胞和未貼壁細胞，貼壁生長的細胞使用不含乳酸的10% 胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時加入lOOU/ml的白介素-2促進細胞增殖。1周后，重 新加入終濃度為IOmM乳酸誘導細胞貼壁生長，挑取細胞克隆接種于6孔板，繼而進行擴大 培養(yǎng)，獲得永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母細胞。
[0044] 5.本發(fā)明獲得的永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母細胞的性能檢測
[0045] (1)流式細胞術檢測乳酸誘導后LCL的細胞表面抗原分子。
[0046] (5~10) X IO5的LCL經磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再分別加入10微升四色標記的 單克隆抗體⑶3/⑶4/⑶8/⑶45,10微升雙標記的單克隆抗⑶3/⑶(16+56)和10微升單標 記⑶19,室溫避光溫育15分鐘，加入500微升生理鹽水混勻后上流式細胞儀分析。
[0047] 結果如圖4所示，細胞表面抗原標記，⑶19和⑶45抗原分子為陽性，⑶3、⑶4、⑶8、 ⑶16、⑶56抗原分子為陰性，LCL細胞為B系來源。
[0048] (2)乳酸誘導后的LCL進行核型分析。
[0049] 分別取EB病毒感染6周后形成的LCL，采用IOmM乳酸作用48小時，每管5毫升， 細胞濃度為2X IO6/毫升，加入終濃度為0. 05毫克/毫升的秋水仙素，置37°C培養(yǎng)箱中處 理2小時；取出細胞，常規(guī)方法制片，Giemsa染色后鏡下觀察。
[0050] 結果如圖5所示，大部分LCL染色體正常，核型正常的LCL有助于獲得穩(wěn)定生長的 細胞株。
[0051] (3) PCR檢測乳酸誘導后的LCL是否攜帶EB病毒核酸分子。
[0052] 目的基因片段來自編碼EB病毒核抗原I(EBNAl)的基因，上游引物5'CCT GTA GGG GAA GCC GAT 3'（SEQ ID NO. 2)和下游引物 5' CAA TGG TGT AAG ACG ACA TT 3'（SEQ ID NO. 3)。反應體系：2 X緩沖液10微升，10毫摩爾/升的上游引物I微升，10毫摩爾/升的 下游引物1微升，模板DNA 1微升，去離子水7微升。反應條件：95°C變性5分鐘；95°C變性 30秒，56 °C退火30秒，72 °C延伸30秒，35個循環(huán)，72 °C延伸8分鐘。配制1 %瓊脂糖凝膠， 取5 μ 1擴增產物與1 μ 1溴酚藍載樣緩沖液混合，加于電泳凝膠板中電壓100伏電泳20分 鐘，在紫外透射儀上觀察結果。
[0053] 結果如圖6所示，乳酸誘導前后的LCL經PCR檢測，PCR產物電泳結果顯示擴增 條帶在300~400堿基對范圍內，與目的片段大?。?87堿基對）一致，均攜帶有EB病毒 EBNA-I基因序列。
[0054] (4) Western Blot檢測乳酸誘導LCL產生細胞外基質。
[0055] 收集細胞：用細胞刮刀將細胞刮下，放置于15毫升離心管中，1000轉/分鐘離心5 分鐘。棄上清，用預冷的磷酸鹽緩沖液洗1次，棄上清。細胞沉淀用100微升細胞裂解液懸 浮，同時加入10微升蛋白酶抑制劑，于冰上裂解20分鐘，每5分鐘震蕩混勻1次。裂解的細 胞于14500轉/分鐘4°C離心5分鐘，收集上清，加等體積的SDS-PAGE上樣緩沖液，100°C煮 5分鐘。配制10%的分離膠與5%的濃縮膠，每個加樣孔點樣10毫升，80伏電泳30分鐘， 調節(jié)電壓至120伏，至溴酚藍跑至凝膠底部，停止電泳。將海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、 海綿按程序疊放，100伏轉膜60分鐘。5%脫脂奶粉（PBS配制）封閉，室溫，30分鐘。TBST 洗滌三次，5分鐘/次，用一抗4°C孵育過夜。TBST洗滌三次，5分鐘/次，用辣根過氧化物 酶標記的二體室溫孵育1小時。TBST洗滌3次，5分鐘/次。磷酸鹽緩沖液洗去膜上殘留 的吐溫，吸干液體，上機，化學發(fā)光系統(tǒng)ECL試劑盒顯影定影。
[0056] 結果如圖7所示，不同時間乳酸誘導LCL，隨著時間的延長LCL可分泌膠原蛋白以 及基質金屬蛋白酶等細胞外基質增加。
[0057] (5) Transwell檢測乳酸作用下LCL的細胞迀移能力。
[0058] 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12小時，去除血清的影響。消化細胞，終 止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗2遍，用不含胎牛血清的無血清培養(yǎng)基重懸。 調整細胞密度至1~IOX 1〇5,取細胞懸液100微升加入孔徑為8. 0微米膜的Transwell小 室，加入乳酸作用48小時，24孔板下室加入500微升含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。將微孔膜 取下，甲醇固定后〇. 1%臺盼藍染色。
[0059] 結果如圖8所示，濃度為IOmM乳酸作用后的LCL較未加乳酸作用的LCL迀移能力 增強。
[0060] 實施例2 :篩選乳酸誘導的合適濃度
[0061] 實驗方法：
[0062] 1.分離外周血中的B細胞，同實施例1
[0063] 2. EB病毒顆粒的制備，同實施例1
[0064] 3.利用EB病毒轉化技術轉化淋巴母細胞，同實施例1
[0065] 4.施加不同的乳酸濃度篩選，濃度分別設置為0mM、5mM、10mM、20mM、30mM、60mM和 80mM〇
[0066] (I)MTT法檢測不同濃度的乳酸對LCL增殖的影響。
[0067] 細胞接種于96孔板中（5 X IO4個/孔），次日加不同濃度的乳酸，對照組設空白對 照和調零組，孵育24小時后，棄上清，PBS清洗兩遍，每孔加入100微升不含乳酸的工作培養(yǎng) 基及10微升MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，直接加入100微升Formazan溶解液，震蕩至顆粒 完全溶解。酶標儀在490nm檢測所有樣本的吸光值OD值，觀察細胞毒性及增殖效應。細胞 活力百分比（％ )=(實驗組OD值-調零孔OD值）八對照組00值-調零孔00值）父100。
[0068] 結果：
[0069] MTT法檢測不同濃度的乳酸對LCL增殖的影響：乳酸濃度在5~20mM范圍內對LCL 細胞活力無顯著差異或者細胞活性增強，在30~SOmM范圍內對LCL細胞活力下降。乳酸 濃度在IOmM時，LCL的活力最高，故選擇該濃度篩選LCL。
[0070] (2)普通光鏡的形態(tài)學觀察，篩選后的LCL在不同濃度乳酸作用下形態(tài)學特征。結 果：如圖2所示，未受乳酸誘導的LCL呈圓球形，體積較正常B細胞大，胞質豐富，呈細胞表 面有突起，細胞呈團懸浮生長（圖2A)。IOmM乳酸誘導后細胞出現呈梭型或不規(guī)則型，細胞 貼壁生長（圖2B)。60mM乳酸作用，細胞裂解死亡（圖2C)。采用乳酸鈉作用后未見B淋巴 母細胞貼壁生長和形態(tài)學改變的現象發(fā)生。
[0071] (3)流式細胞術檢測不同濃度乳酸作用下，LCL存在的自發(fā)性細胞凋亡。結果如圖 3所示，未受乳酸誘導的LCL自發(fā)性細胞凋亡的比例為0. 5%左右（圖3A)。IOmM乳酸誘導 后細胞凋亡比例小于1% (圖3B)。60mM乳酸作用，細胞大量死亡，晚凋和早凋的比例超過 80% (圖 3C)。
[0072] 以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。
【主權項】
1. 一種永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： ㈧利用淋巴細胞分離液和磁珠分選獲取B淋巴細胞，加入淋巴細胞激活物促進B細胞 增殖，提高淋巴細胞的數量，再運用EBV轉化技術獲得永生化的淋巴母細胞； (B)通過給步驟（A)中制備的永生化的淋巴母細胞施加乳酸壓力篩選，待懸浮生長的 永生化的淋巴母細胞出現上皮樣細胞分化、貼壁生長時，去除上層懸浮生長的細胞，挑取單 個克隆的細胞接種于96孔板，繼而進行擴大培養(yǎng)，獲得永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母 細胞。2. 根據權利要求1所述的永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母細胞的制備方法，其特征 在于，所述的步驟（B)中加入乳酸后乳酸在總溶液中的濃度為10mM。3. 根據權利要求1所述的永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母細胞的制備方法，其特征 在于，所述的步驟（A)中的淋巴細胞分離液是Ficoll-hypaque混合物或Percoll細胞分離 液。4. 根據權利要求1所述的永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母細胞的制備方法，其特征 在于，所述的步驟（A)中加入的淋巴細胞激活物是寡核苷酸CpG2006,IL-2,IL-4或IL-6。5. -種采用權利要求1-4任一所述的制備方法制備得到的永生化上皮樣細胞分化的B 淋巴母細胞模型。6. 根據權利要求5所述的永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母細胞模型在B細胞淋巴瘤 機制研究、藥物篩選或藥物評價中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學生物工程領域，具體是一種永生化上皮樣細胞分化的B淋巴母細胞模型及其制備方法和應用。本發(fā)明通過EB病毒轉化正常的B細胞為永生化的LCL，對永生化的B細胞施加乳酸誘導培養(yǎng)，獲得上皮樣細胞分化、分泌大量細胞外基質的細胞，該細胞遷移能力增強，為研究B細胞淋巴瘤的惡性演變提供研究工具。
【IPC分類】C12Q1/02, C12N15/869, C12N5/10
【公開號】CN105400820
【申請?zhí)枴緾N201510874988
【發(fā)明人】莫小輝, 譚飛
【申請人】上海市皮膚病醫(yī)院
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月2日