一組用于表皮葡萄球菌實時熒光pcr檢測的特異性引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測方法技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一組用于表皮葡萄球菌實時熒光 PCR檢測的特異性引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮葡萄球菌(在自然界中分布廣泛,是一種重 要的機會致病菌,是血漿凝固酶陰性的葡萄糖球菌。SE引起的醫(yī)院感染是多部位的,其致 病性隨細(xì)菌侵入途徑、菌量、毒力及機體免疫力不同而異,尤其是SE引起的敗血癥,易被原 發(fā)病所掩蓋,一旦發(fā)現(xiàn)病已危重,預(yù)后差。此外,SE引起的臨床感染好發(fā)于血液病的顆粒細(xì) 胞缺乏癥及實體惡性腫瘤的病人,主要是由于大量使用免疫抑制劑和廣譜抗生素,還與嚴(yán) 重原發(fā)病長期住院過程中易發(fā)生的呼吸道、手續(xù)傷口、氣管切開、留置導(dǎo)尿及靜脈導(dǎo)管等感 染有關(guān)。SE對多種抗菌素具有耐藥性,造成臨床治療的困難。近年來隨著抗生素的廣泛應(yīng) 用,醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步,該菌從各種臨床樣本的分離率日益升高,甚至超過金黃色葡萄球菌而 居革蘭氏陽性菌之首位,成為了醫(yī)院感染的重要致病菌。
[0003] SE感染的診斷至今仍是一個難題。由于SE廣泛存在,為常見的細(xì)菌培養(yǎng)的污染 菌,目前主要依靠不同部位感染的臨床表現(xiàn)和在血液、腦脊液、尿、分泌物的涂片及培養(yǎng)中 找到的病原菌作為診斷依據(jù)。此方法需經(jīng)過增菌培養(yǎng)、選擇篩選、生化鑒定、血清分型等流 程,耗時一周左右,不利于快速、準(zhǔn)確的對表皮葡萄球菌進(jìn)行檢測。用免疫酶試驗、免疫擴(kuò)散 法、乳膠凝集試驗和免疫熒光法及酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法檢測SE的結(jié)果尚不理想。近年 來發(fā)展起來的實時焚光定量PCR (Fluorescence quantitative PCR)技術(shù)從常規(guī)PCR定性 檢測邁上量化的臺階,實現(xiàn)了 PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍,避免了傳統(tǒng)PCR定量鑒定中交 叉污染的問題,它相對于常規(guī)PCR技術(shù)先進(jìn)、操作簡便,實現(xiàn)了實時監(jiān)測、絕對定量和快速 檢測的目的,同時具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優(yōu)點。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于設(shè)計一組表皮葡萄球菌特異性引物和探針序列,建立一種能 廣泛應(yīng)用于表皮葡萄球菌檢測的快速、靈敏、特異性好的熒光定性或定量PCR檢測的方 法。本發(fā)明采用基因克隆技術(shù),將表皮葡萄球菌聚集相關(guān)蛋白(Accumulation associated protein)基因片段插入到載體pMD18-T中,獲得含有Aap基因片段的重組質(zhì)粒,以此作為 標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)表皮葡萄球菌Aap的基因片段編碼基因序列設(shè)計并合成一組特異性引物和探 針,優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,建立以實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)為平臺的檢測方法,并對所建立 的方法進(jìn)行評估。
[0005] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn): 本發(fā)明的第一個目的是提供一組用于表皮葡萄球菌實時熒光PCR檢測的特異性引物 和探針,所述特異性引物和探針的核苷酸序列為(1)_(3)中的一種: (1) 、上游引物:5'_ TCGGATCTCCATCAACT -3' 下游引物:5'_ TCAAACAACGCAACCAG -3' 探針:5' - TTTTGTCACATCATCCACTGG -3' 所述引物和探針擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No. 2; (2) 、與(1)所述序列互補的序列。
[0006] 經(jīng)實驗驗證,將(1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至數(shù)個堿基或刪減一 至數(shù)個堿基得到的引物序列也能很好的擴(kuò)增上述目標(biāo)核苷酸序列。
[0007] 作為優(yōu)選,所述探針的5'端熒光報告基團(tuán)是FAM、TET、JOE、HEX或VIC,3'端標(biāo)記 的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA、DABCYL或BHQ。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供表皮葡萄球菌的實時熒光定量PCR檢測試劑盒,所述 試劑盒為表皮葡萄球菌的定性或定量檢測試劑盒;所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物 和探針; 作為優(yōu)選,所述定量檢測試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品,所述標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為:將表皮葡萄 球菌保守基因片段插入到載體PMD18-T中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得含有表 皮葡萄球菌保守基因片段的重組質(zhì)粒,以此作為標(biāo)準(zhǔn)品;所述表皮葡萄球菌保守基因片段 參見序列表中SEQ ID No. 1 ; 作為進(jìn)一步優(yōu)選,所述表皮葡萄球菌保守基因片段是以表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA 為模板,使用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的: 上游引物:5' -TTTAACACGCTCTTCACCTG-3' 下游引物:5'_ GTAGTCAAACAACGCAACCA -3' ; 作為最優(yōu)選,所述PCR擴(kuò)增的條件為:94°C預(yù)變性5min;94°C 30s、60°C 30s、72°C lmin,35 個循環(huán);72°C lOmin。
[0009] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述特異性引物和探針、試劑盒在定性或定量檢測表 皮葡萄球菌含量中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的是提供表皮葡萄球菌的實時熒光定量PCR檢測方法,步驟如 下: (1)制備標(biāo)準(zhǔn)品:將表皮葡萄球菌保守基因片段插入到載體PMD18-T中,轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得含有表皮葡萄球菌保守基因片段的重組質(zhì)粒,以此作為標(biāo)準(zhǔn)品;所 述表皮葡萄球菌保守基因片段參見序列表中SEQ ID No. 1 ; (2 )標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制; (3) 使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采用相同的反應(yīng)體 系進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增; (4) 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值進(jìn)行表皮葡萄球菌的快速定量檢測。
[0011] 作為優(yōu)選,所述表皮葡萄球菌保守基因片段是通過以下引物擴(kuò)增得到的: 上游引物為 5' -TTTAACACGCTCTTCACCTG-3' ; 下游引物為 5'- GTAGTCAAACAACGCAACCA -3' ; 作為優(yōu)選,PCR擴(kuò)增所述表皮葡萄球菌保守基因片段的條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C 30s、6(TC 30s、72°C lmin,35 個循環(huán);72°C IOmin; 作為優(yōu)選,步驟(3)中所述引物和探針的用量均為I. 6 μ I ; 作為優(yōu)選,步驟(3)中所述實時熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2分鐘,94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號,40個循環(huán)。
[0012] 本發(fā)明的第五個目的是提供表皮葡萄球菌的定性PCR檢測方法,步驟如下: (1) 使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增; (2) 通過待測樣品的Ct值對表皮葡萄球菌進(jìn)行定性檢測:當(dāng)Ct值小于38時,為陽性; 否則,為陰性; 作為優(yōu)選,步驟(1)中所述引物和探針的用量均為1. 6 μ 1 ; 作為優(yōu)選,步驟(1)中所述實時熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2分鐘,94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號,40個循環(huán)。
[0013] 本發(fā)明的第六個目的是提供上述試劑盒的使用方法,步驟如下: (1)制備標(biāo)準(zhǔn)品:將表皮葡萄球菌保守基因片段插入到載體PMD18-T中,轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得含有表皮葡萄球菌保守基因片段的重組質(zhì)粒,以此作為標(biāo)準(zhǔn)品;所 述表皮葡萄球菌保守基因片段參見序列表中SEQ ID No. 1 ; (2 )標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制; (3) 使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采用相同的反應(yīng)體 系進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增; (4) 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的Ct值進(jìn)行表皮葡萄球菌的快速定量檢測。
[0014] 作為優(yōu)選,所述表皮葡萄球菌保守基因片段是通過以下引物擴(kuò)增得到的: 上游引物為 5' -TTTAACACGCTCTTCACCTG-3' ; 下游引物為 5' - GTAGTCAAACAACGCAACCA -3'。
[0015] 作為優(yōu)選,PCR擴(kuò)增所述表皮葡萄球菌保守基因片段的條件為:94°C預(yù)變性5min ; 94°C 30s、6(TC 30s、72°C lmin,35 個循環(huán);72°C IOmin; 作為優(yōu)選,步驟(3)中所述引物和探針的用量均為I. 6 μ I ; 作為優(yōu)選,步驟(3)中所述實時熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2分鐘,94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號,40個循環(huán)。
[0016] 本發(fā)明的第七個目的是提供試劑盒的使用方法,步驟如下: (1) 使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增; (2) 通過待測樣品的Ct值對表皮葡萄球菌進(jìn)行定性檢測:當(dāng)Ct值小于38時,為陽性; 否則,為陰性。
[0017] 作為優(yōu)選,步驟(1)中所述引物和探針的用量均為1.6μ1 ; 作為優(yōu)選,步驟(1)中所述實時熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2分鐘,94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號,40個循環(huán)。
[0018] 本發(fā)明提供用于對表皮葡萄球菌進(jìn)行定性、定量檢測的引物和探針,