5 μ L ddH20 10. 5 μ L〇
[0034] 擴(kuò)增程序 / 反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 5min ;94°C 30s、55°C 30s、72°C lmin，35 個(gè)循 環(huán)；72°C IOmin。
[0035] (8)采用百泰克公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取陽性重組質(zhì)粒，測定濃度和純度， 同時(shí)吸取一部分純化質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，確定插入片段的基因序列 與目的序列一致。
[0036] 四、標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量 1、 將步驟三得到的含有重組質(zhì)粒pMD18-T-SE_Aap的大腸桿菌DH5 α 100 μ L轉(zhuǎn)種于5mL 的LB液體培養(yǎng)基，37°C 200rpm過夜搖培； 2、 取Iml培養(yǎng)過夜的菌液轉(zhuǎn)種于30ml LB液體培養(yǎng)基，200rpm增菌培養(yǎng)2-3小時(shí)，然 后采用北京百泰克公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取質(zhì)粒。
[0037] 3、利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可見分光光度計(jì)（ND5000)對 提取的質(zhì)粒進(jìn)行測定，測定A 26。、A28。，根據(jù)A2M/A2S。判斷質(zhì)粒的純度； 4、質(zhì)粒pMD18-T-SE-Aap濃度(拷貝數(shù)）計(jì)算 (1) 質(zhì)粒的分子量=2886bpX660 (每對堿基的平均分子量） (2) 測得質(zhì)粒濃度為103. 36ng/ μ 1，質(zhì)粒純度A26Q/A2SQ=2. 05，A26Q/A23Q=2. 01。因在進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光定量PCR時(shí)，需要以"拷貝數(shù)"為單位，因此需要將單位轉(zhuǎn)換成copies/ml。
[0038] 質(zhì)粒copies/ml=阿伏伽德羅常數(shù)X質(zhì)粒摩爾數(shù) 其中阿伏伽德羅常數(shù)=6. 02X 1023copies/mol。
[0039] 因此提取的質(zhì)粒濃度 copies/ml=103 X 10 9g/ml X 6. 02 X 1023copies/mol + (2886bpX660g/bp*mol) =3. 3X 1010copies/ml 10 μ I質(zhì)粒+23 μ I的無菌水就得到濃度為1.0 OX K^copies/ml的質(zhì)粒，再將該質(zhì)粒 進(jìn)行10倍比稀釋就可得到一系列濃度的質(zhì)粒，并于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0040] 實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測表皮葡萄球菌方法的建立 一、特異性引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 以上述選取的表皮葡萄球菌的Aap基因的保守片段為革El目標(biāo)，應(yīng)用Primer express 3 軟件、Primer Premier 5軟件以及Oligo 7軟件，設(shè)計(jì)了一組實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物和探 針。
[0041] 作為本發(fā)明的核心，一組用于表皮葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的引物和探針核苷 酸序列如下： 上游引物：SE-Aap-189F 5'- TCGGATCTCCATCAACT -3' 下游引物：SE-Aap-298R 5'- TCAAACAACGCAACCAG -3' 探針：SE-Aap-214P 5'- TTTTGTCACATCATCCACTGG -3' 探針5'端的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，同時(shí)也可以標(biāo)記 其他的熒光報(bào)告基團(tuán)如TET、JOE、HEX、VIC和熒光淬滅基團(tuán)如DABCYL、BHQ等。
[0042] 該引物和探針擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列為： 5' -TCGGATCTCCATCAACTGGACCATATTTTGTCACATCATCCACTGGTGGTGTGACTACTTCGCCTGTATC AGGATTTTTAACTCCTGGCTTACCTGGTTGCGTTGTTTGA-3 '。
[0043] 二、待測樣本的制備 A、樣本總RNA的制備 (1) 將組織放入研缽中，加入液氮磨碎，每50-100mg組織加入1ml Trizol，用勻漿器進(jìn) 行勻漿處理； (2) 將勻漿樣品在室溫（15~30°C )放置5分鐘，取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作； (3) 每1ml Trizol加入0. 2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘； (4) 4°C 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，將水相轉(zhuǎn)移到新管中，每1ml Trizol加入 0. 5ml異丙醇或者Iml冰乙醇，-80°C冰柜凍存或于_80°C冰柜凍存30分鐘以上； (5) 4°C 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄去上清； (6) 每1ml Trizol至少加 Iml 75%乙醇。4°C不超過7500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上 清； (7) 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，加入25~200 μ 1無 RNase的水，吹打混勻， 55~60°C放置10分鐘使RNA溶解，-70°C保存。
[0044] B、反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄體系及擴(kuò)增條件：總mRNA(10pg-l μ g) 10 μ 1，Oligo(dT) 1 μ 1，70°C變性10 分鐘，插入冰中冷卻10分鐘，加入dNTP I μ I，逆轉(zhuǎn)錄酶0· 5 μ I，5 X RT Buffer 0· 5 μ I，PCR 專用水7μ1，42Γ反應(yīng)2小時(shí)。-20°C保存。
[0045] 三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件優(yōu)化 以濃度為1.0 OX l〇6copies/ml的陽性質(zhì)粒為模板，采用百泰克公司生產(chǎn)的 2Xreal-time PCR Premixture (probe)實(shí)時(shí)焚光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)采用的 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為上海楓嶺生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的FTC-3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。 反應(yīng)體系采用20ul體系，其中引物和探針的量采用表1組合進(jìn)行反應(yīng)。
[0046] 表1 PCR反應(yīng)體系中引物和探針不同用量
反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性2分鐘，94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。結(jié) 果參照圖1，數(shù)據(jù)顯示20μ1體系時(shí)，引物（5μΜ)和探針（5μΜ)分別加入1.6μ1時(shí)，Ct值 最小，熒光信號最強(qiáng)。
[0047] 四、方法評估 1、靈敏度實(shí)驗(yàn) 將上述制備得到的質(zhì)粒進(jìn)行10倍比稀釋得到一系列濃度的質(zhì)粒，選取濃度為 I. 00 X 108copies/ml、I. 00 X 107copies/ml、I. 00 X 106copies/ml、I. 00 X 105copies/ml、 L OOX 104copies/ml、L OOX 103copies/ml、L OOX 102copies/ml 等作為梯度模板。反應(yīng)體 系如下： 2 X premix 10 μ 1 Primer F (5 μ Μ) 1. 6 μ 1 Primer R (5 μ Μ) 1. 6 μ 1 Probe (5 μ Μ) 1. 6 μ 1 模板 2 μ 1 (IdH2O 補(bǔ)至 20 μ 1。 反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性2分鐘，94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號，40個(gè)循環(huán)。 根據(jù)儀器所檢測到的熒光信號經(jīng)軟件處理獲得熒光曲線，觀察熒光曲線的信號，結(jié)果參照 圖2,數(shù)據(jù)顯示當(dāng)質(zhì)粒濃度達(dá)到1.00X 103C〇pieS/ml時(shí)依然有熒光信號，但質(zhì)粒濃度達(dá)到 1.0 OX 102copies/ml時(shí)未檢測到熒光信號，因此該方法的靈敏度為1.0 OX 103copies/ml。
[0048] 2、特異性實(shí)驗(yàn) 為了證實(shí)本發(fā)明對表皮葡萄球菌檢測的特異性，我們選取了其他常見臨床感染微生物 特異性實(shí)驗(yàn)，選取的微生物包括：金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、化膿鏈球菌、大腸埃希 菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、糞腸球菌、乙 型溶血性鏈球菌、福氏志賀氏菌、腦膜炎奈瑟菌、表皮葡萄球菌。
[0049] 該特異性試驗(yàn)包括用上述樣本的基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行的試驗(yàn)。上述微 生物的DNA提取均采用北京百泰克基因組DNA提取試劑盒（DP2001)，RNA提取均采用百泰 克RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒（RP1202)，cDNA合成均采用百泰克Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒，采用百泰克公司生產(chǎn)的2Xreal_time PCR Premixture (probe) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系如下： 2 X premix 10 μ 1 Primer F (5 μ Μ) 1. 5 μ 1 Primer R (5 μ Μ) 1. 5 μ 1 Probe (5 μ Μ) 1. 5 μ 1 模板 2 μ 1 (IdH2O 補(bǔ)至 20 μ 1。
[0050] 反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性2分鐘，94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號，40個(gè)循 環(huán)。根據(jù)儀器所檢測到的熒光信號經(jīng)軟件處理獲得熒光曲線，觀察熒光曲線的信號，分析特 異性。結(jié)果參考圖3,從圖3可以看出：不管以cDNA為模板還是以基因組DNA為模板，僅表 皮葡萄球菌檢測為陽性，其余微生物均為陰性，表明本發(fā)明具有很好的特異性。檢測結(jié)果如 表2所示。
[0051] 表2特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 以不同拷貝數(shù)的