一種培育無選擇標記抗除草劑轉基因植物的方法及其專用載體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種培育無選擇標記抗除草劑轉基因植物的 方法及其專用載體。
【背景技術】
[0002] 自1983年世界上首例轉基因煙草（Nicotianatabacum)在美國成功種植以來 (Zambryskitetal.，1983)，轉基因作物種植面積持續(xù)增加。截止2014年，全球28個國家 轉基因作物的種植面積為1. 815億公頃，比2013年的1. 752億公頃增加了 630萬公頃，年增 長率為3%~4%。轉基因作物的抗除草劑性狀自1996年商業(yè)化種植以來對全球糧食、飼 料和纖維生產做出了巨大的貢獻，2014年抗除草劑性狀被單獨或復合應用于玉米、水稻、棉 花、油菜、苜蓿、茄子、甜菜和白楊等主要糧食作物和經(jīng)濟作物（James，2015)。通過轉基因技 術使農作物獲得對除草劑的耐性，不僅克服了除草劑的選擇性問題，使多滅生性廣譜除草 劑得到廣泛應用，而且更重要的是提高了除草劑效果，降低了除草成本。當前，中國的水稻、 玉米、大豆、小麥和油菜等作物雜草危害相當嚴重，而傳統(tǒng)的選擇性除草劑在使用過程中需 要增加施用量，且殘留期長、容易影響后續(xù)作物的正常生長。因此，在中國開展抗除草劑轉 基因育種具有巨大的市場需求。
[0003] 所有除草劑都是通過干擾與抑制植物生長發(fā)育過程中的代謝作用而造成雜草的 死亡，其中包括光合作用、細胞分裂、氨基酸、蛋白質及脂肪酸合成、激素合成、葉綠素及色 素合成等。除草劑草甘膦（glyphosate)特異性地抑制植物和細菌中芳香族氨基酸合成關 鍵酶的活性，即抑制植物和細菌中5-稀醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolypyruvylshiki mate-3-phosphatesynthase，EPSPS)的活性。當施用草甘膦時，進入植物體內的草甘膦分 子與磷酸烯醇丙酮酸競爭性地結合EPSPS的活性位點，終止了芳香族氨基酸的合成途徑， 造成苯丙氨酸、絡氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最終導致植物死亡。
[0004] 隨著植物轉基因技術的發(fā)展，研究人員可以利用多種轉化方法將抗草甘膦基因轉 化到植物體內，但通常只有部分細胞可以成為穩(wěn)定的轉化細胞。因此，一般在轉化過程中使 用抗生素抗性基因等作為選擇標記基因篩選轉化細胞。在選擇壓力下，不含選擇標記及其 產物的非轉化細胞將死亡；轉化細胞和組織則整合有選擇標記基因而存在抗性，從而能夠 繼續(xù)成活并分化成植株。但是，選擇標記基因及其蛋白產物畢竟不是基因工程的目的產品， 盡管目前的研究表明多數(shù)選擇標記基因及其產物并未帶來安全性隱患，但有些人仍會擔心 這些基因存在于轉基因植物中會帶來影響環(huán)境和人類健康安全性的問題。如果培育出不含 選擇標記基因的轉基因植物，這個問題即會迎刃而解?？偠灾o選擇標記植物抗草 甘膦的轉基因水稻的培育方法具有重要的意義，不僅為培育抗逆、高產、優(yōu)質的新品種提供 重要的材料基礎，同時隨著抗除草劑作物種植面積的擴大和市場效益的提高，必將進一步 推動新型除草劑的開發(fā)和利用。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是培育無選擇標記抗除草劑轉基因植物。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了 一種植物表達載體。
[0007] 本發(fā)明所提供的植物表達載體，包含區(qū)段甲和區(qū)段乙；
[0008] 所述區(qū)段甲依次可包括如下元件：T-DNA右邊界、選擇標記基因表達盒、T-DNA左 邊界；
[0009] 所述區(qū)段乙依次可包括如下元件：T-DNA右邊界、抗除草劑基因表達盒、T-DNA左 邊界。
[0010] 所述區(qū)段甲中的T-DNA右邊界和所述區(qū)段乙中的T-DNA右邊界的核苷酸序列均可 如序列表中序列1自5'末端起第491至516位所示。
[0011] 所述區(qū)段甲中的T-DNA左邊界和所述區(qū)段乙中的T-DNA左邊界的核苷酸序列均可 如序列表中序列1自5'末端起第7182至7207位所示。
[0012] 所述區(qū)段乙依次可包括如下元件：所述T-DNA右邊界、MAR序列甲、所述抗除草劑 基因表達盒、MAR序列乙和所述T-DNA左邊界。
[0013] 所述MAR序列甲和所述MAR序列乙均可為核基質結合序列，置于外源表達結構的 兩側可提高外源基因表達的水平，或明顯減少了外源基因在轉基因植株間的表達差異。利 用MARs來穩(wěn)定、提高外源基因的表達是克服外源基因失活的一種有效方法。
[0014] 所述植物表達載體中，所述選擇標記基因表達盒和所述抗除草劑基因表達盒的方 向相反。
[0015] 所述選擇標記基因表達盒的核苷酸序列的反向互補序列可如序列表中序列1自 5'末端起第13533至15604位所示。
[0016] 所述抗除草劑基因表達盒的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第1797 至5620位所示。
[0017] 所述除草劑可為草甘膦。
[0018] 所述抗除草劑基因具體可為EPSPS基因；
[0019] 所述EPSPS基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第3708至5351 位所示。
[0020] 所述區(qū)段甲的核苷酸序列的反向互補序列可如序列表中序列1自5'末端起第 13458至276位所示（序列表中序列1為環(huán)形質粒的序列，因此所述區(qū)段甲自上游至下游依 次由序列表中序列1自5'末端起第13458至15859位核苷酸和序列表中序列1自5'末端 起第1至276位所示核苷酸組成）。
[0021] 所述區(qū)段乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第491至7207位所示。
[0022] 所述植物表達載體具體可為環(huán)狀質粒。
[0023] 所述植物表達載體的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。
[0024] 上述任一所述植物表達載體在培育無選擇標記抗除草劑轉基因植物中的應用也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種培育無選擇標記抗除草劑轉基因植物的方法。
[0026] 本發(fā)明所提供的培育無選擇標記抗除草劑轉基因植物的方法，可包括bl)或b2):
[0027] bl)將上述任一所述植物表達載體轉化受體植物，借助所述選擇標記基因或其對 應的表型進行篩選，得到T。代植株；將所述T。代植株進行自交，得到含有所述抗除草劑基因 且不含有所述選擇標記基因的?\代植株，即無選擇標記抗除草劑轉基因植株；
[0028] b2)將上述任一所述植物表達載體轉化受體植物，借助條件甲和條件乙進行篩選， 得到T。代植株；將所述T。代植株進行自交，得到含有所述抗除草劑基因且不含有所述選擇 標記基因的?\代植株，即無選擇標記抗除草劑轉基因植株；所述條件甲為所述選擇標記基 因或其對應的表型；所述條件乙為所述抗除草劑基因或其對應的表型。
[0029] 上述方法中，用所述植物表達載體轉化受體植物時，所述抗除草劑基因和所述選 擇標記基因通常非連鎖整合到受體植物的基因組中，所述具有選擇標記基因表型的植株在 很大概率上也具有所述抗除草劑基因。同時具有抗除草劑基因和所述選擇標記基因的植株 進行自交后，獲得的后代中抗除草劑基因和選擇標記基因發(fā)生分離，因此可以獲得無選擇 標記抗除草劑轉基因植株。
[0030] 所述受體植物可為如下al)至a6)中的任一種：
[0031] al)雙子葉植物；
[0032] a2)單子葉植物；
[0033] a3)水稻；
[0034] a4)秈稻；
[0035] a5)水稻品種明恢86 ;
[0036] a6)粳稻。
[0037] 所述除草劑可為草甘膦。
[0038] 所述抗除草劑基因具體可為EPSPS基因；
[0039] 所述EPSPS基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起第3708至5351 位所示。
[0040] 所述選擇標記基因可為潮霉素磷酸轉移酶編碼基因。
[0041] 所述潮霉素磷酸轉移酶編碼基因的核苷酸序列可如序列表中序列1自5'末端起 第13777至14799位所示。
[0042] 實驗證明，利用本發(fā)明提供的方法，可篩選出無選擇標記的轉基因后代，獲得無選 擇標記的轉基因水稻的比率為42. 39% ;與野生型水稻幼苗相比，利用本發(fā)明提供的方法培 育的無選擇標記的轉基因水稻對草甘膦有明顯的抗性?？梢姡S著抗除草劑作物種植面積 的擴大和市場效益的提高，本發(fā)明提供的方法將進一步推動新型除草劑的開發(fā)和利用。
【附圖說明】
[0043] 圖1為植物表達載體pDTepsps-hyg的結構示意圖。
[0044] 圖2為水稻的遺傳轉化。
[0045] 圖3為T。代轉基因水稻植株的PCR分析電泳圖。
[0046] 圖4為T。代轉基因水稻植株的hpt基因和印sps基因連鎖情況的電泳圖。
[0047] 圖5為?\代轉基因水稻植株的PCR分析電泳圖。
[0048] 圖6為Τ2代轉基因水稻植株的草甘膦抗性分析。
【具體實施方式】
[0049] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0050] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0051] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052] 秈稻品種明恢86記載于如下文獻中：蘇軍等.農桿菌介導秈稻明恢86高效穩(wěn)定 轉化體系的建立。福建農業(yè)學報，2003，18 (4)，209-213.公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生 物學研究所獲得。秈稻品種明恢86以下簡稱為明恢86或野生型水稻。
[0053] YEB液體培養(yǎng)基：將牛肉浸膏5g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgS04*7H20 0.04g 溶于1L去離子水，用10M NaOH水溶液調節(jié)pH至7. 2,高溫高壓滅菌20min。
[0054] 誘導培養(yǎng)基：將50XN6大量母液20mL、100XB5微量母液10mL、200XMS鐵鹽母 液5mL、1000 XB5有機母液lmL、水解酪蛋