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一種培育無選擇標記抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物的方法及其專用載體的制作方法_2

文檔序號:9661491閱讀:來源:國知局
白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2. 8g、2,4-D 2. Omg、蔗糖30. 0g和植物凝膠4. 5g溶于1L蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至5. 8,121°C滅菌15min。
[0055] 共培養(yǎng)培養(yǎng)基:將50XN6大量母液20mL、100XB5微量母液10mL、200XMS鐵鹽 母液5mL、1000 X B5有機母液lmL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2. 8g、2, 4-D 2. Omg、鹿糖30. 0g、植物凝膠4. 5g、羧節(jié)青霉素100mg和頭孢霉素400mg溶于1L蒸餾水,調(diào) 節(jié)pH至5. 2,121 °C滅菌15min,待冷卻至50~60°C時加入經(jīng)過0. 22μΜ過濾除菌的葡萄糖 l〇g、羧芐青霉素l〇〇mg和頭孢霉素400mg和乙酰丁香酮,乙酰丁香酮在體系中的終濃度為 100μMo
[0056] 預培養(yǎng)基:將50XN6大量母液20mL、100XB5微量母液10mL、200XMS鐵鹽母 液5mL、1000XB5有機母液lmL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2. 8g、2,4-D 2.Omg、蔗糖30. 0g、植物凝膠4. 5g溶于1L蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至5· 8,121°C滅菌15min,待冷 卻至50~60°(:時加入經(jīng)過0.22以1過濾除菌的葡萄糖108、羧芐青霉素10011^和頭孢霉素 400mg〇
[0057] 一次篩選培養(yǎng)基:將50XN6大量母液20mL、100XB5微量母液10mL、200XMS鐵鹽 母液5mL、1000XB5有機母液lmL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2. 8g、2,4-D 2. Omg、蔗糖30. 0g、植物凝膠4. 5g溶于1L蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至5. 8,121°C滅菌15min,待冷卻 至50~60°C時加入經(jīng)過0.22μΜ過濾除菌的潮霉素30mg、羧芐青霉素100mg和頭孢霉素 400mg〇
[0058] 二次篩選培養(yǎng)基:除將一次篩選培養(yǎng)基中的潮霉素30mg替換為潮霉素50mg,其它 成分及含量均不變。
[0059] 分化培養(yǎng)基:將20XMS大量母液50mL、200XMS微量母液5mL、200XMS鐵鹽母液 5mL、200XMS有機母液5mL、水解酪蛋白lOOOrng、谷氨酰胺500mg、蔗糖30. 0g、山梨醇20g、 NAA0· 4mg、6_BA2.Omg、KTlmg和植物凝膠4. 5g溶于1L蒸饋水,調(diào)節(jié)pH至5. 8,121°C滅 菌 15min〇
[0060] 生根培養(yǎng)基:將20XMS大量母液25mL、200XMS微量母液2. 5mL、200XMS鐵鹽母 液2. 5mL、200XMS有機母液2. 5mL、蔗糖15g和植物凝膠4. 5g溶于1L蒸餾水,調(diào)節(jié)pH至 5.8,121°(:滅菌151^11,待冷卻至50~60°(:時加入經(jīng)過0.22以1過濾除菌的潮霉素3011^。
[0061] 1/2MS培養(yǎng)液:將20XMS大量母液25mL、200XMS微量母液2. 5mL、200XMS鐵鹽 母液2. 5mL、200XMS有機母液2. 5mL溶于1L蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH至5.8。
[0062] 50XN6大量母液的溶質(zhì)及其濃度為:141.50g/L KN03、20g/L ΚΗ2Ρ04、23· 15g/ L(NH4)2S04、9. 25g/L MgS04·7Η20、8· 30g/LCaCl2 ·2H20,溶劑為水,pH自然。
[0063] 100XB5微量母液的溶質(zhì)及其濃度為:0·3g/LH3B03、lg/LMnS04 ·4Η20、0· 0025g/L CoCl2.6H20、0.0025g/LCuS04.5H20、0.2g/LZnS04.7H20、0.025g/LNa2Mo04.2H20、0.075g/ L KI,溶劑為水,pH自然。
[0064] 1000XB5有機母液的溶質(zhì)及其濃度為:2g/L甘氨酸、lOOg/L肌醇、lg/L煙酸、lg/ L鹽酸吡哆醇、10g/L鹽酸硫胺素,溶劑為水,pH自然。
[0065] 20XMS大量母液的溶質(zhì)及其濃度為:38. 00g/LΚΝ03,8· 80g/LCaCl2 ·2Η20,7· 40g/ LMgS04 · 7Η20,3· 40g/LΚΗ2Ρ04,33·OOg/LNH4N03,溶劑為水,pH自然。
[0066] 200XMS微量母液的溶質(zhì)及其濃度為:4. 46g/LMnS04 ·4Η20,0· 166g/LKI,1. 24g/ LΗ3Β03,1· 72g/LZnS04 · 7Η20,0· 050g/LNa2Mo04 · 2Η20,0· 005g/LCuS04 · 5Η20,0· 005g/L C〇Cl2 · 6H20,溶劑為水,pH自然。
[0067] 200XMS鐵鹽母液的溶質(zhì)及其濃度為:5. 56g/LFeS04 · 7Η20,7· 46g/L Na2 ·EDTA· 2H20,溶劑為水,pH自然。
[0068] 200XMS有機母液的溶質(zhì)及其濃度為:20g/L肌醇,lOOmg/L煙酸,lOOmg/L鹽酸吡 咳醇,l〇〇mg/L鹽酸硫胺素,400mg/L甘氨酸,溶劑為水,pH自然。
[0069] 實施例1、無選擇標記抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及草甘膦抗性鑒定
[0070] -、植物表達載體pDTepsps-hyg的構(gòu)建
[0071] 人工合成序列表中序列1所示的植物表達載體pDTepsps-hyg(環(huán)形質(zhì)粒,結(jié)構(gòu)示 意圖見圖1)。序列表的序列1中,自5'末端起第491-516位為右邊界B序列,第563-1309位 為第一個MAR序列,第1797-3707位為P-Ubi啟動子序列,第3708-5351位為EPSPS基因序 列,第5358-5620位為T-nos終止子序列,第6045-6906位為第二個MAR序列,第7182-7207 位為左邊界B序列,第13458-13483位為左邊界A序列,第13533-13748位為CaMV35SpolyA 終止子序列,第13777-14799位為hpt基因序列,第14835-15604位為CaMV35Spromoter 序列,第251-276位為右邊界A序列。
[0072] 二、水稻的遺傳轉(zhuǎn)化和T。代轉(zhuǎn)基因水稻植株的分子檢測
[0073]1、將步驟一構(gòu)建的植物表達載體pDTepsps-hyg通過電擊導入根癌農(nóng)桿菌 LBA4404,得到重組農(nóng)桿菌,命名為LBA4404-pDT印sps-hyg。
[0074] 2、將LBA4404-pDT印sps-hyg單克隆接種于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平 50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基,28°C、220rpm震蕩培養(yǎng)12~16h后,然后按2% -4% (體積百 分含量)的比例接種于含乙酰丁香酮100μΜ的YEB液體培養(yǎng)基,28°C、220rpm振蕩培養(yǎng)至 〇D_值達到0. 5左右,得到農(nóng)桿菌侵染液。
[0075] 3、成熟明恢86種子去殼脫粒,置于100mL三角瓶中,加入70% (體積百分比)乙醇 水溶液浸泡30sec,再置于25% (體積百分比)次氯酸鈉水溶液中,120rpm震蕩滅菌30min, 無菌水沖洗3次,用濾紙吸干水分,然后將種子胚朝下置于誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷,30°C全 光照誘導7天,長出的愈傷掐芽后用于水稻轉(zhuǎn)化(圖2中的A)。
[0076] 4、完成步驟3后,取生長狀態(tài)較好的胚性愈傷組織,浸泡于步驟2得到的農(nóng)桿菌侵 染液,28°C、80rpm搖床輕搖愈傷,侵染30min,然后,放在鋪有一層滅菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng) 基上,25°C暗培養(yǎng)4天。
[0077] 5、完成步驟4后,取愈傷組織置于無菌培養(yǎng)皿中,用含Cef400mg/L的無菌水漂洗 2~3次,在無菌濾紙上吸干,然后置于預培養(yǎng)基上,25°C暗培養(yǎng)3~4天。
[0078] 6、取步驟5得到的愈傷組織,置于一次篩選培養(yǎng)基,光照交替培養(yǎng)2周后,更換新 的一次篩選培養(yǎng)基,愈傷組織繼續(xù)光照交替培養(yǎng)2周,將原愈傷組織上長出的抗性愈傷組 織轉(zhuǎn)移至二次篩選培養(yǎng)基上,光照交替培養(yǎng)2周(圖2中B)。所述光照交替培養(yǎng)即光培養(yǎng) 和暗培養(yǎng)交替,條件為:28°C; 14小時光照培養(yǎng)/10小時黑暗培養(yǎng);光照培養(yǎng)時的光照強度 為 90μE/m2/s。
[0079] 7、完成步驟6后,取生長旺盛的抗性愈傷組織,置于分化培養(yǎng)基,光照交替培養(yǎng) (即光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)交替,條件為:28°C;14小時光照培養(yǎng)/10小時黑暗培養(yǎng);光照培養(yǎng)時 的光照強度為90μE/m2/s) 3周,抗性愈傷組織上分化出抗性小芽(圖2中C)。
[0080] 8、完成步驟7后,取抗性小芽,置于生根培養(yǎng)基,光照交替培養(yǎng)(即光培養(yǎng)和暗 培養(yǎng)交替,條件為:28°C;14小時光照培養(yǎng)/10小時黑暗培養(yǎng);光照培養(yǎng)時的光照強度為 90μE/m2/s),得到抗性植株(圖2中D)。待抗性植株長至6~10cm時,進行開放式水培 養(yǎng),長出新根后移栽溫室,得到188個T。代轉(zhuǎn)基因水稻植株。然后用CTAB法分別提取188 個T。代轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片的基因組DNA。
[0081] 10、分子檢測
[0082] 分別用T。代轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片的基因組DNA作為模板,采用引物lhpt-F: 5'-CGGTCGGCATCTACTCTATT-3' 和引物2hpt-R:5'-CGTTATGTTTATCGGCACTTT-3' 組成的引物對甲進行PCR擴增,用于鑒定hpt基因;采用引物1印sps-F: 5'-TTGGTGACTTGGTTGTCGGGTTG-3,和引物2印sps-R:5,-CGTAGGTGTCGATTGCCGTGATG-3' 組成的引物對乙進行PCR擴增,用于鑒定印sps基因;采用引物11ink-F: 5'-GATTGTGCGTCATCCCTTAC-3' 和引物 21ink-R:5'-ACATCGTCTCTGCCTCCTCT-3' 組成的引物 對丙進行PCR擴增,用于鑒定hpt基因和印sps基因是否連鎖整合。
[0083]PCR反應條件:94°C,5 分鐘;94°C30 秒,55°C30 秒,72°C60 秒,30 個循環(huán);72°C延 伸5分鐘。
[0084] 采用引物對甲進行PCR擴增,獲得的電泳圖見圖3中A,采用引物對乙進行PCR擴 增,獲得的電泳圖見圖3
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