一種輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物及其基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量pcr評(píng) ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)生物標(biāo)志物領(lǐng)域，具體涉及血漿microRNA -27a_3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的醫(yī)藥用途。本發(fā)明還涉及血楽microRNA -27a-3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的評(píng)價(jià)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]急性缺血性腦卒中是指因腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧性壞死，而出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征(Brott T，Bogousslavsky J.Treatment ofacute ischemic stroke.N Engl J Med，2000，(343):710_722)。目前在臨床上，缺血性腦卒中超早期的診斷、病情評(píng)估主要還是依靠病史及臨床表現(xiàn)、頭顱電子計(jì)算機(jī)斷層掃描CT或磁共振成像MRI及正電子發(fā)射斷層掃描PECT等檢查(Liebeskind DS，Sanossian N，YongWH?Starkman S，Tsang MP，Moya AL，Zheng DD，Abolian AM，Kim D，Ali LK，Shah SH，Towfighi A，0vbiagele B，Kidwell CS，Tateshima S，Jahan R，Duckwiler GR?Vinuela F，Salamon N，Villablanca JP ?Vinters HV，Marder VJ? Saver JL.CT and MRI earlyvessel signs reflect clot composit1n in acute stroke.Stroke，2011，(42):1237-1243； Hanson SK，Grotta JC，Rhoades H，Tran HD，Lamki LM?Barron BJ，Taylor WJ.Value of single-photon emiss1n-computed tomography in acute stroketherapeutic trials.Stroke，1993，(4): 1322-1329)，但均有其局限性，CT 在其超早期一般不能顯示病灶，而MR1、PECT雖可以顯示，但設(shè)備昂貴不能廣泛普及。但是在腦卒中早期，血清生化標(biāo)志物的變化較早于影像學(xué)(CT、MRI)檢查，并且檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行。因此，血清生化標(biāo)志物是當(dāng)前研究缺血性腦卒中診斷及治療的熱點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，一些血清標(biāo)志物和缺血性腦卒中的發(fā)展與病情評(píng)估密切相關(guān)，比如細(xì)胞間黏附分子l(ICAM-l)(Iida Η，Schmeichel AM ，Wang Y ，Schmelzer JD ，Low PA?Orchestrat1n of the inflammatoryresponse in ischemia-reperfus1n injury?J Peripher Nerv Syst，2007，(12):131-138)、超敏C反應(yīng)蛋白(CRP)(律靜，同型半胱氨酸聯(lián)合超敏C反應(yīng)蛋白、D-二聚體、頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度與腦梗死的關(guān)系，陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013，(42): 1602-1603)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)(黃招君，李輝華，李名生，神經(jīng)元特異性烯醇化酶與急性腦梗死的相關(guān)性研究，中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2013，(3):12-14)、超氧化物酶(S0D )(陸建明，馬云寶，高雷華，缺血性腦卒中患者血漿ET-CGRP和血清MDA?S0D的測(cè)定及其意義.，標(biāo)記免疫分析與臨床，2005,(12):7-9)等。
[0003]MicroRNAC miRNA)是長(zhǎng)度21?25 nt的RNA分子，可以特異性識(shí)別靶mRNA并調(diào)控編碼基因的表達(dá)，它們通過(guò)促進(jìn)mRNA降解或抑制基因轉(zhuǎn)錄而影響mRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)。miRNA可調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞分化、增殖、代謝、耐藥和細(xì)胞死亡(Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms:Growth?death?fat?stress?andtiming.Cell，2003，(113):673-676)?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，miRNA異常的表達(dá)與急性缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后關(guān)系密切(Rink C，Khanna S.MicroRNA in ischemicstroke et1logy and pathology,Phys1l Genomics，2011，(43): 521-528)，比較急性缺血性腦卒中患者血漿miRNA表達(dá)譜的差異，有助于發(fā)現(xiàn)腦卒中早期診斷和預(yù)測(cè)療效及患者預(yù)后新的生物標(biāo)志物，調(diào)節(jié)具有生物標(biāo)志物的miRNA表達(dá)可能成為預(yù)測(cè)和治療急性缺血性腦卒中的新方法，結(jié)合傳統(tǒng)影像學(xué)診療方法與相關(guān)血漿生物標(biāo)記物也為急性缺血性腦卒中的治療研究提供了新的策略。綜上，設(shè)計(jì)或?qū)ふ乙越】等伺c急性缺血性腦卒中患者血漿中差異microRNA對(duì)預(yù)防和治療急性缺血性腦卒中具有積極意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物。本發(fā)明尋找健康人與急性缺血性腦卒中患者血漿中的差異mi croRNA，采用mi croRNA芯片檢測(cè)血漿miRNA表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定miRNA表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上考察了microRNA _27a_3p對(duì)急性缺血性腦卒中的診斷效能。本發(fā)明還提供血楽microRNA _27a_3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)方法。
[0005 ]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題，
一種輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物，其特征在于，為血漿中的microRNA-27a_3p0
[0006]本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，提供血漿microRNA -27a_3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的基因芯片評(píng)價(jià)方法，其步驟包括，
(1)抽取受試者清晨空腹外周血3mL于氟化鈉/草酸鉀管內(nèi)，并在2 h內(nèi)，于4 °C，3 000r/min離心10 min，留取上層血楽置于-80 °C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2)血楽miRNA的提取按照miRcutemiRNA提取分離試劑盒說(shuō)明書，采用吸附柱法提取血楽miRNA;
(3)采用Affymetrix2.0昂飛芯片檢測(cè)血楽miRNA表達(dá)水平。
[0007]本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題為血漿microRNA_27a_3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)方法，其步驟包括，
(1)抽取每例受試者清晨空腹外周血3mL于氟化鈉/草酸鉀管內(nèi)，并在2 h內(nèi)，于4 °C，3000 r/min離心10 min，留取上層血楽置于-80 °(3冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2)按照ReverseTranscript1n System說(shuō)明書，使用miR-27a_3p引物將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;
(3)按照GoTaqOqPCR Master Mix說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR，以5 s為內(nèi)參；
(4)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在LightCycler1.5儀器進(jìn)行，以2—(AAet)表示每個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量，每例樣本重復(fù)檢測(cè)3次，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS15.0軟件，結(jié)果采用X 土 s表示。
[0008]作為優(yōu)化，所述5s、miR-27a-3p引物由上海伯豪生物醫(yī)藥有限公司提供；
作為優(yōu)化，步驟(4)中，結(jié)果正態(tài)分布連續(xù)變量資料采用t檢驗(yàn)，非連續(xù)變量資料采用x2檢驗(yàn)，以接受者操作特征曲線(R0C)檢驗(yàn)診斷效能。
[0009]本發(fā)明采用基因芯片結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了血楽microRNA-27a_3p的差異性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上考察了microRNA _27a_3p對(duì)急性缺血性腦卒中的診斷效能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血楽microRNA _27a_3p在急性缺血性腦卒中患者血漿中表達(dá)水平顯著低于健康人水平，并初步確定了通過(guò)mi croRNA _27a_3p輔助診斷急性缺血性腦卒中患者的臨界值及靈敏度和特異度。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中miR-27a-3p在急性缺血性腦卒中患者和健康者血漿中的相對(duì)表達(dá)情況；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中血楽miR-27a-3p濃度的ROC曲線分析。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)得到南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院的承認(rèn)與允許，所有標(biāo)本的采集均獲得入組人員的知情同意。
[0012]對(duì)比例1
研究對(duì)象選取2014年4月至2015年4月就診于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及病房的急性缺血性腦卒中患者32例和體檢中心的健康老年者3