4例為研究對(duì)象。對(duì)照組健康體檢老年者，無腦卒中、肝、腎、血液病、自身免疫性疾病、甲狀腺病、妊娠和腦血管病史，對(duì)照組1選取健康老年者6例，選取男3例及女3例，對(duì)照組1為(64.8 ± 2.97 )歲。
[0013]實(shí)施例1
病例組入選標(biāo)準(zhǔn)所有患者診斷符合全國第四屆腦血管病診斷標(biāo)準(zhǔn)，全部病例均經(jīng)臨床及頭顱CT或MRI掃描確診，不包括心源性、動(dòng)脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤等引起的腦卒中。進(jìn)行基因芯片檢測(cè)的病例組1選取急性缺血性腦卒中患者6例，選取男3例及女3例，病例組1年齡(65.1 ±3.52)歲。兩組間人員的年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0014]將對(duì)照組1和病例組1進(jìn)行血漿microRNA _27a_3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的基因芯片評(píng)價(jià)方法，其步驟包括，
(1)抽取受試者清晨空腹外周血3mL于氟化鈉/草酸鉀管內(nèi)，并在2 h內(nèi)，于4 °C，3 000r/min離心10 min，留取上層血楽置于-80 °C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2)血楽miRNA的提取按照miRcutemiRNA提取分離試劑盒說明書，采用吸附柱法提取血楽miRNA;
(3)采用Affymetrix4.0昂飛芯片檢測(cè)血楽miRNA表達(dá)水平。
[0015]血楽miRNA的提取按照miRcute miRNA提取分離試劑盒(Genepharma公司)說明書，采用吸附柱法提取血漿miRNA。采用Affymetrix 4.0昂飛芯片檢測(cè)血漿miRNA表達(dá)水平，miRNA芯片檢測(cè)試驗(yàn)由上海伯豪生物醫(yī)藥有限公司完成。microRNA芯片檢測(cè)結(jié)果通過芯片對(duì)6例急性缺血性腦卒中患者和6例對(duì)照組血楽microRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果提示，可篩選出57個(gè)急性缺血性腦卒中相關(guān)的差異表達(dá)microRNA基因(P< 0.05)。相較于健康者，35個(gè)急性缺血性腦卒中患者血漿表達(dá)下調(diào)，22個(gè)表達(dá)上調(diào)，其中表達(dá)下調(diào)5倍以上基因的是miR-27a_3p、miR-129、miR-19b、let-71、miR-101a、miR-106b、miR-22、miR-181a、miR-181c;表達(dá)上調(diào)3倍以上的是miR-121、miR-146b、miR-146b、let-7b、miR-155等。以兩組間microRNA表達(dá)量的差異倍數(shù)，即相對(duì)表達(dá)量(log2)的絕對(duì)值> 2.0且丨檢驗(yàn)？ < 0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p的表達(dá)水平在急性缺血性腦卒中患者中顯著低于對(duì)照組(log2=-
5.64，P= 2.13X10—5)0
[0016]對(duì)比例2
對(duì)照組2選取健康受試者28例，男女各14例，年齡(65.7 ± 2.98)歲。
[0017]實(shí)施例2
進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病例組2的急性缺血性腦卒中患者26例，男14例，女12例，年齡(64.5±2.54)歲。兩組間人員的年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0018]血楽microRNA _27a_3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)方法，其步驟包括，
(1)抽取每例受試者清晨空腹外周血3mL于氟化鈉/草酸鉀管內(nèi)，并在2 h內(nèi)，于4 °C，3
000r/min離心10 min，留取上層血楽置于-80 °(3冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2)按照ReverseTranscript1n System(美國Promega公司A3500)說明書，使用miR-27a-3p引物將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
(3)按照GoTaqOqPCR Master Mix(美國Promega公司A6001)說明書進(jìn)行焚光定量PCR，以5 s為內(nèi)參;5 s、miR-27a-3p引物由上海伯豪生物醫(yī)藥有限公司提供；
(4)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在LightCycler1.5儀器(瑞士Roche公司)進(jìn)行，以2—(AAGt)表示每個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量，每例樣本重復(fù)檢測(cè)3次，實(shí)驗(yàn)過程中采用盲法研究，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS15.0軟件;結(jié)果采用X 土 s表示，正態(tài)分布連續(xù)變量資料采用t檢驗(yàn)，非連續(xù)變量資料采用X2檢驗(yàn)，以接受者操作特征曲線(R0C)檢驗(yàn)診斷效能。
[0019]實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)26例患者、28名健康對(duì)照的芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，病例組2中miR-27a-3p的相對(duì)表達(dá)量為9.781X10—4土1.421X 10一4，對(duì)照組2為5.862X 10—4±2.357 X 10—4。病例組2表達(dá)量僅為對(duì)照組的12 %，兩組間差異顯著(F=24.59，P< 0.001)，結(jié)果與miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果一致。
[0020]miR-27a-3p對(duì)急性缺血性腦卒中的診斷效能R0C分析結(jié)果顯示，血楽miR-27a-3p濃度的R0C曲線分析對(duì)血楽miR-27a-3p濃度檢測(cè)指標(biāo)運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行R0C曲線分析。miR-27a-3p濃度R0C曲線下面積(area under the ROC curve,AUC)為0.758 (95% Cl為0.704?0.811，Ρ< 0.0Do當(dāng)血楽miR-27a-3p濃度為 1051 fmol/L時(shí)，血楽miR-27a_3p對(duì)急性缺血性腦卒中診斷的特異度和靈敏度均較高，分別為91.2 %和73.4 %。
[0021]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血漿microRNA _27a_3p在急性缺血性腦卒中患者血漿中表達(dá)水平顯著低于健康人水平，并確定了通過microRNA _27a_3p輔助診斷急性缺血性腦卒中患者的臨界值及靈敏度和特異度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物，其特征在于，為血漿中的microRNA-27a_3p02.如權(quán)利要求1所述血漿microRNA_27a_3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的基因芯片評(píng)價(jià)方法，其步驟包括， (1)抽取受試者清晨空腹外周血3 mL于氟化鈉/草酸鉀管內(nèi)，并在2 h內(nèi)，于3 000 r/min離心10 min，留取上層血楽置于-80 °(3冰箱保存?zhèn)溆茫? (2 )血楽m i R NA的提取按照m i R c u t e m i RNA提取分離試劑盒說明書，采用吸附柱法提取血楽miRNA;2.0昂飛芯片檢測(cè)血楽miRNA表達(dá)水平。3.如權(quán)利要求1所述血漿microRNA_27a_3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)方法，其步驟包括， (1)抽取每例受試者清晨空腹外周血3mL于氟化鈉/草酸鉀管內(nèi)，并在2 h內(nèi)，于4 °C，3000 r/min離心10 min，留取上層血楽置于-80 °(3冰箱保存?zhèn)溆茫? (2)按照ReverseTranscript1n System說明書，使用miR-27a_3p引物將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA; (3)按照GoTaqOqPCR Master Mix說明書進(jìn)行熒光定量PCR，以5 s為內(nèi)參； (4)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在LightCycler1.5儀器進(jìn)行，以2—(AAet)表示每個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量，每例樣本重復(fù)檢測(cè)3次，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS15.0軟件，結(jié)果采用X 土 s表示。4.如權(quán)利要求3所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)方法，其特征在于，所述5s、miR-27a-3p引物由上海伯豪生物醫(yī)藥有限公司提供。5.如權(quán)利要求3所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)方法，其特征在于，步驟(4)中，結(jié)果正態(tài)分布連續(xù)變量資料采用t檢驗(yàn)，非連續(xù)變量資料采用x2檢驗(yàn)，以接受者操作特征曲線(R0C)檢驗(yàn)診斷效能。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物，為血漿中的microRNA-27a-3p。本發(fā)明還公開了血漿microRNA？-27a-3p作為輔助診斷急性缺血性腦卒中的早期生物標(biāo)志物的基因芯片評(píng)價(jià)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明采用基因芯片結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了血漿microRNA？-27a-3p的差異性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上考察了microRNA？-27a-3p對(duì)急性缺血性腦卒中的診斷效能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血漿microRNA？-27a-3p在急性缺血性腦卒中患者血漿中表達(dá)水平顯著低于健康人水平，并初步確定了通過microRNA？-27a-3p輔助診斷急性缺血性腦卒中患者的臨界值及靈敏度和特異度。
【IPC分類】C12N15/113, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105441550
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510985489
【發(fā)明人】呂燕妮, 付龍生, 陳璿瑛, 魏筱華, 溫金華, 歐陽愛軍
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年12月25日