p樣品杯于105°C烘箱干燥30min，取出轉移到干燥器內，冷卻至5min后， 稱重（即為W1)。準確稱取2.000g(即為W2)液體發(fā)酵后的樣品置于FiberCap樣品杯中，將樣 品杯放入浸提燒杯，加入400mL中性洗滌劑和lmL十氫化萘及2g無水亞硫酸鈉。將燒杯套上 冷凝裝后置于加熱板上，煮沸l(wèi)〇min，持續(xù)微沸60min。煮沸完畢后，用新鮮的熱水重復洗滌 三次。將樣品杯放入烘箱中130°C烘干2h后，在干燥器中冷卻至室溫，稱重（即為W3)。
[0136] 2.3.2、酸性洗滌纖維(ADF)測定
[0137]將上述烘干稱重后含有中性洗滌纖維的FiberCap樣品杯置于浸提燒杯中，加入 100mL酸性洗滌劑和lmL十氫化萘及2g無水亞硫酸鈉。將燒杯套上冷凝裝后置于加熱板上， 煮沸l(wèi)Omin，持續(xù)微沸60min。煮沸完畢后，用新鮮的熱水重復洗滌三次。將樣品杯放入烘箱 中130°C烘干2h后，在干燥器中冷卻至室溫，稱重（即為W4)。
[0138] 2.3.3、酸性洗滌木質素(ADL)測定
[0139]將上述烘干稱重后含有中性洗滌纖維的FiberCap樣品杯置于浸提燒杯中，加入 72%硫酸，20°C消化3h后過濾，用新鮮的熱水重復洗滌三次。將樣品杯放入烘箱中130°C烘 干2h后，在干燥器中冷卻至室溫，稱重（即為W5)。
[0140] 2.3.4、酸不溶灰分(AIA)測定
[0141]將樣品杯置于預干燥并稱重(W6)的灰化坩堝(45X60mm)中，在馬弗爐中600°C灰 化4h。待坩堝緩慢冷卻至大約200°C時，取出放于干燥器;冷卻至室溫后稱重(W6)。
[0142]將所得數(shù)據(jù)通過SPSS19.0軟件分析，利用Duncan法進行多重比較，結果以標記字 母法標明各菌株的顯著差異性。各計算公式如下：
[0143]中性洗滌纖維(NDF)含量：
[0144] NDF(%)= (W3-ffl)/W2X100%；
[0145] 酸性洗滌纖維(ADF)含量：
[0146] ADF(%) = (W4-W3)/W2X100%；
[0147] 酸性洗滌木質素(ADL)含量：
[0148] ADL(%)=W5/W2X100%；
[0149]半纖維素(Hemicellulose)含量：
[0150] Hemicellulose(%) =NDF(%) -ADF(%)；
[0151]纖維素(Cellulose)含量：
[0152] Cellulose(%)=ADF(%)-W5/ff2X100%；
[0153]木質素(Lignin)含量：
[0154]Lignin(%)=W5/W2X100% -W6/W2X100%；
[0155] 2.4結果與分析
[0156] 2.4.1木質素、纖維素和半纖維素含量測定
[0157]玉米秸桿經菌株發(fā)酵處理30d后，纖維素、半纖維素和木質素含量測定結果如表10 和圖8所示。
[0158]表10菌株降解后玉米秸桿中各組分平均含量
[0159]
[0160]注:空白對照組不接入菌種，陽性對照組接入5%中農綠康(北京)生物技術有限公 司生產的復合微生物菌劑。采用Duncan法進行多重比較。顯著性水平p= 0.01和p= 0.05分 別以大小寫字母表示，n= 3。
[0161] 由表10和圖8可知，玉米猜桿經肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā) 酵處理30d后，木質素含量為9.02±4.43%，均小于空白對照組和陽性對照組中玉米秸桿木 質素含量；以顯著水平P= 〇 .05分析，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵 處理的玉米秸桿中木質素含量與空白對照組玉米秸桿中木質素含量比較差異不顯著，與陽 性對照組玉米秸桿中木質素含量比較差異不顯著；以顯著水平p= 〇.01分析，肺炎克雷伯氏 菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理的玉米猜桿中木質素含量與空白對照組玉米猜 桿中木質素含量比較差異不顯著，與陽性對照玉米秸桿組中木質素含量比較差異不顯著； 說明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252可以降解木質素。
[0162] 玉米秸桿經液體發(fā)酵30d后，纖維素含量為33.65 ± 2.59 %，均大于空白對照組和 陽性對照組中玉米秸桿纖維素含量；以顯著水平P= 0.05分析，肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理的玉米猜桿中纖維素含量與空白對照組玉米猜桿 中纖維素含量比較差異不顯著，與陽性對照組中玉米秸桿纖維素含量比較差異不顯著；以 顯著水平P= 〇.01分析，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理的玉米猜 桿中纖維素含量與空白對照組中玉米秸桿的纖維素含量比較差異不顯著，與陽性對照組中 玉米猜桿的纖維素含量比較差異不顯著;說明肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) L252不能降解纖維素。
[0163]玉米秸桿經液體發(fā)酵30d后，半纖維素含量為24.33 ± 2.61 %，大于空白對照組中 玉米秸桿半纖維素含量，小于陽性對照組中玉米秸桿半纖維素含量；以顯著水平P= 〇.05分 析，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理的玉米猜桿中半纖維素含量 與空白對照組玉米秸桿中半纖維素含量比較差異不顯著，與陽性對照組玉米秸桿中半纖維 素含量比較差異顯著；以顯著水平P= 〇.〇1分析，肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneUm〇niae)L252發(fā)酵處理玉米秸桿中的半纖維素含量與空白對照組玉米秸桿中半纖維素 含量比較差異不顯著，與陽性對照組玉米秸桿中半纖維素含量比較差異不顯著；說明肺炎 克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252不能夠降解半纖維素。
[0164] 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252具有木質素降解能力，可以高效 降解木質素。作為單一菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252對木質素的降 解能力強于復合微生物菌劑，經復合微生物菌劑發(fā)酵處理的玉米秸桿中木質素含量是經肺 炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理的玉米猜桿中木質素含量的1.3倍。
[0165] 2.5結論
[0166] 經【具體實施方式】一篩選出的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252具有 木質素降解能力，可以高效降解木質素。經復合微生物菌劑發(fā)酵處理的玉米秸桿中木質素 含量是經肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252發(fā)酵處理的玉米猜桿中木質素含 量的1.3倍，作為單一菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)L252對木質素的降解 能力強于復合微生物菌劑。
[0167] 3、全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀測定
[0168] 3.1、材料與試劑
[0169] 3.1.1、培養(yǎng)基
[0170]液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g，蛋白胨2g，NH4N03 1.0g，CaCl20.2g，K2HP〇40.5g， FeCl30.02，MgS〇4.7H200.5g，NaCl l.Og，蒸餾水1000mL，pH 7.0。
[0171] 搖瓶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：蛋白胨2g，NH4N03 1.0g，CaCl20.2g，K2HP〇40.5g，F(xiàn)eCl3 0.02，MgS〇4.7H200.5g，NaCl l.Og，蒸餾水1000mL，pH 7.0。
[0172] 3.1.2、玉米秸桿粉
[0173] 玉米秸桿于2012年10月取自黑龍江省哈爾濱市黑龍江大學呼蘭校區(qū)本實驗室試 驗田，烘干，粉碎過40目篩，備用
[0174] 3.2、試驗方法
[0175] 3.2.1、液體發(fā)酵
[0176] 將【具體實施方式】一篩選出的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252接種 到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中制成〇D6Q() = 0.5的菌懸液，然后以5 % (mL/mL)接種量將菌液接入含有 7.5 %玉米秸桿粉的搖瓶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，玉米秸桿粉使用間歇滅菌法滅菌，121°C濕熱 滅菌30min，每個菌株設三次重復，37°C180r/min振蕩培養(yǎng)30d，采用冷凍真空干燥法進行干 燥。設置一組空白對照組和一組陽性對照組，即空白對照組不接菌種，陽性對照組接入5 % (g/mL)菌劑，其他操作均與上述操作相同。
[0177] 3.2.2、試樣溶液制備
[0178] 試樣溶液參照中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準NY525-2012進行，但有所改進。
[0179]精確稱取3.2.1中冷凍干燥后的試樣0.5g(精確至0.001g)，置于凱氏燒瓶底部，用 少量水沖洗沾附在瓶壁上的試樣，加5mL硫酸和1.5mL過氧化氫，小心搖勻，瓶口放以彎頸小 漏斗，放置過夜，在可調電爐上緩慢升溫至硫酸冒煙，取下，少冷加15滴過氧化氫，輕輕搖動 凱氏燒瓶，加熱l〇min，取下，稍冷后在家5滴~10滴過氧化氫并分次消煮，直至溶液呈無色 或淡黃色清液后