，繼續(xù)加熱l〇min，除盡剩余的過氧化氫。取下稍冷，小心加水至30mL，加熱 至沸騰。取下冷卻，用少量水沖洗彎頸小漏斗，洗液放入原凱氏燒瓶中，將消煮液移入l〇〇mL 容量瓶中，加水定容，用無磷濾紙過濾到干燥的藍蓋試劑瓶中，備用。設置三組空白對照組， 除不加試樣外，其他操作與上述操作相同。
[0180] 3.2.3、全氮測定
[0181] 全氮測定方法參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY525-2012和NY/T297-1995進 行，但有所改進。
[0182] 吸取3.2.2中制備的消煮清液1〇1^于5〇11^容量瓶中，加入21^硼酸和20(^1^混合指 示劑混合液，加水定容至50mL。利用凱氏定氮儀進行蒸餾，用硫酸標準溶液滴定餾出液，由 藍色變至紫紅色為終點，記錄消耗硫酸標準液體積(mL)?？瞻诇y定所消耗硫酸標準液體積 不得超過〇.lmL，否則重新測定。全氮(N)含量以g/kg表示，按下述公式計算：
[0184]式中：
[0185] V一一試液滴定消耗硫酸標準溶液的體積，mL;
[0186] Vo--空白滴定消耗硫酸標準溶液的體積，mL;
[0187] c一一硫酸標準溶液的濃度，mol/L;
[0188] 0.014--與1.OOmL硫酸（1 /2H2S〇4)標準溶液相當?shù)囊钥吮硎镜牡馁|(zhì)量；
[0189] D一一分取倍數(shù)，定容體積/分取體積，100/10;
[0190]m--稱取試樣質(zhì)量，g;
[0191] 1000一一換算成每千克試樣的含量。
[0192] 3.2.4、全磷測定
[0193] 全磷測定方法參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY525-2012和NY/T298-1995進 行，但有所改進。
[0194] 吸取磷標準溶液0、1 · 00、2 · 00、3 · 00、4 · 00、5 · 00、6 ·OOmL分別置于7個50mL容量瓶 中，加入與吸取試樣溶液等體積的空白溶液，加水至30mL，加400yL2，6-二硝基酚指示劑溶 液，用氫氧化鈉溶液和硫酸溶液調(diào)節(jié)溶液剛呈微黃色，加10.OmLf凡鉬酸銨試劑，搖勻，用水 定容至50mL。此溶液為lmL含磷(？)0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.0(^8的標準溶液系列。 在室溫15°C以上條件下放置20min后，在分光光度計波長440nm處用2cm光徑比色皿，以空白 溶液調(diào)節(jié)儀器零點，進行比色，讀取吸光度，根據(jù)磷濃度和吸光度繪制標準曲線，求出直線 回歸方程。吸取3.2.2中制備的消煮清液10mL于50mL容量瓶中，加水至30mL，與標準溶液系 列同條件顯色、比色，讀取吸光度。全磷含量以g/kg表示，按下述公式計算：
[0196]式中：
[0197] c一一由回歸方程求得顯色液磷濃度，yg/mL;
[0198] V--顯色體積，50mL;
[0199] D--分取倍數(shù)，定容體積/分取體積，100/10;
[0200]m--稱取試樣質(zhì)量，g;
[0201] 10-3-一將yg/g換算成g/kg的因數(shù)。
[0202] 3.2.5、全鉀測定
[0203] 全鉀測定方法參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY525-2012和NY/T299-1995進 行，但有所改進。
[0204] 吸取鉀標準溶液0、2.50、5.00、7.50、10.00!^分別置于5個5011^容量瓶中，加入與 吸取試樣溶液等體積的空白對照溶液，用水定容，此溶液為lmL含鉀(K)0、5.00、10.00、 15.00、20.OOyg的標準溶液系列。在火焰光度計上，以空白溶液調(diào)節(jié)儀器零點，以標準溶液 系列中最高濃度的標準溶液調(diào)節(jié)滿值至80分度出。再依次由低濃度至高濃度測量其他標準 溶液，記錄儀器示值。根據(jù)鉀濃度和儀器示值繪制校準曲線或求出直線回歸方程。吸取 3.2.2中制備的消煮清液5.OOmL于50mL容量瓶中，用水定容。與標準溶液系列同條件在火焰 光度計上側定，記錄儀器示值。每測量5個樣品后需用鉀標準溶液校正儀器。全鉀含量以g/ kg表示，按下述公式計算：
[0206] 式中：
[0207]c--由回歸方程求得測定液濃度，yg/mL;
[0208] V--測定體積，本操作為50mL;
[0209] D一一分取倍數(shù)，定容體積/分取體積，100/5;
[0210]m--稱取試樣質(zhì)量，g;
[0211] 10-3-一由yg/g換算為g/kg的因數(shù)。
[0212] 3.2.6、速效磷測定
[0213] 全鉀測定方法參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T300-1995進行，但有所改 進。
[0214] 精確稱取3.2.1中冷凍干燥后的試樣1.0(^置于5〇1^三角瓶內(nèi)，加入2〇11^25°(3的 檸檬酸溶液，加塞，在25°C下振蕩30min，用無磷濾紙過濾至干燥的藍蓋試劑瓶中，備用。設 置三組空白對照組，除不加試樣外，其他操作與上述操作相同。測定方法與3.2.4相同。速效 磷含量以mg/kg表示，按下述公式計算：
[0216] 式中：
[0217] c一一由回歸方程求得顯色液磷濃度，yg/mL;
[0218] V--顯色體積，50mL;
[0219] D一一分取倍數(shù)，試樣提取液體積/分取體積，20/5;
[0220]m--稱取試樣質(zhì)量，g。
[0221] 3.2.7、速效鉀測定
[0222] 精確稱取3.2.1中冷凍干燥后的試樣1.00g置于5OmL三角瓶內(nèi)，加入1OmL硝酸溶 液，插上小漏斗，在電爐上微沸1 〇min，趁熱過濾于50mL容量瓶中，用熱水洗滌5次，冷卻后定 容。設置三組空白對照組，除不加試樣外，其他操作與上述操作相同。測定方法與3.2.5中相 同。速效鉀含量以mg/kg表示，按下述公式計算：
[0224]式中：
[0225] c--由回歸方程求得測定液鉀濃度，yg/mL;
[0226]V--測定體積，50mL;
[0227] m--稱取試樣質(zhì)量，g。
[0228] 3.3、結果與分析
[0229 ] 3.3.1、全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量測定
[0230]玉米秸桿經(jīng)菌株液體發(fā)酵處理30d后，進行全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀測 定，結果如表11和圖9~圖11所示。玉米秸桿經(jīng)過液體發(fā)酵后，按照差異顯著性水平p= 0.05 和p= 0.01分析，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252發(fā)酵處理組的全氮、全磷、 全鉀、速效磷和速效鉀含量與空白對照組相比均差異不顯著。因此，菌株對玉米秸桿進行降 解時不會影響其中的主要元素含量，試樣依舊保存原有肥效。
[0231]表11發(fā)酵處理后玉米秸桿中主要元素含量
[0234] 注:空白對照組不接入菌種。采用Duncan法進行多重比較。顯著性水平p=0.01和p = 0.05分別以大小寫字母表示，n= 3。
[0235] 3.4結論
[0236] 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)L252對玉米猜桿液體發(fā)酵處理30d后， 試樣中的全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量均無明顯變化。肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiellapneumoniae)L252在降解樣品時，不會引起樣品中的主要元素含量，不會導致 試樣中的全氮、全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量變化，樣品依舊保存原有肥效。
【主權項】
1. 一株木質(zhì)纖維素類物質(zhì)高效降解菌L252,其特征在于它為肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiellapneumoniae)L252,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年12月12日，保藏號CGMCC No.10161。2. 如權利要求1所述的一株木質(zhì)纖維素類物質(zhì)高效降解菌L252的應用，其特征在于它 用于降解木質(zhì)纖維素類物質(zhì)。
【專利摘要】一株木質(zhì)纖維素類物質(zhì)高效降解菌L252及其應用，它涉及一株木質(zhì)纖維素類物質(zhì)高效降解菌L252及其應用。它為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella？pneumoniae)L252，于2014年12月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC？No.10161。它用于降解木質(zhì)纖維素類物質(zhì)。本發(fā)明菌株具有增值迅速，適應性強，應用廣泛；經(jīng)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella？pneumoniae)L252發(fā)酵處理后的袋料木耳廢料的失重率在30％以上，經(jīng)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella？pneumoniae)L252發(fā)酵處理后的玉米秸稈的失重率在26％以上。CGMCC No.1016120141212
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/22
【公開號】CN105462875
【申請?zhí)枴緾N201510861060
【發(fā)明人】楊微, 劉春光, 楊峰山, 孫永帥, 吳奇, 王鯤鵬, 王慶華, 魏才強, 張慧, 曲金玲, 于文全
【申請人】北京德瑞豐農(nóng)業(yè)科技有限責任公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月1日