SacI/BamHI)鑒定和測(cè)序鑒定。
[0033] 并且在本發(fā)明中采用該步驟S21-24最終獲得的鑒定正確的重組質(zhì)粒，可以用于 步驟S40中作為導(dǎo)入至感受態(tài)腸道大腸桿菌的重組質(zhì)粒，這一做法相比步驟S20中用DNA 連接酶連接后的質(zhì)粒，可以100%保證腸道大腸桿菌中所轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的重組質(zhì)粒為含有目的 基因的pCR2.lc-TOPO或pTrcHis-B質(zhì)粒；而采用步驟S20中DNA連接酶連接后質(zhì)粒，無(wú)法 保證100%連接成功，也無(wú)法保證導(dǎo)入至腸道大腸桿菌的質(zhì)粒為能夠正確表達(dá)目的基因的 質(zhì)粒，因此采用步驟S21-S24進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，并且重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證，可 以保證導(dǎo)入的正確性。
[0034] 本發(fā)明的上述方法步驟綜合利用綠色熒光蛋白基因和原始腸道大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)， 構(gòu)建出可穩(wěn)定在動(dòng)物腸道菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒PCR2. 1c-TOPO-EGFP(弱控制型）或pTrcHis B-EGFP(可調(diào)控的強(qiáng)控制型），標(biāo)記的動(dòng)物腸道大腸桿菌可用于示蹤研究，實(shí)時(shí)跟蹤檢測(cè)動(dòng) 物腸道菌在逆境環(huán)境下（如不同藥物處理）的變化或變異情況，或用于研究微生物在食物 和環(huán)境中的生長(zhǎng)變化、以及可用于許多其他相關(guān)研究。相比現(xiàn)有標(biāo)記工程菌，取料于原始腸 道大腸桿菌，并且具有卡那霉素或氨芐青霉素等抗性，逆境環(huán)境下可以具有更優(yōu)的競(jìng)爭(zhēng)性， 并且其表達(dá)還可以通過(guò)跟蹤需求進(jìn)行控制。
[0035] 為使本發(fā)明上述步驟更加易于理解，以及使本領(lǐng)域技術(shù)人員在上述步驟之上能夠 清楚具體實(shí)施細(xì)節(jié)，以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)行舉例說(shuō)明：
[0036] 實(shí)施例1
[0037]S10,以含有EGFP相應(yīng)基因序列的質(zhì)粒pEGFP-C3作為原料，然后采用上述引物進(jìn) 行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增出大小約為720bp的EGFP基因片段；
[0038]
[0039] 其中擴(kuò)增過(guò)程采用PCR反應(yīng)體系（50μ1)進(jìn)行：
[0040]
[0041] 擴(kuò)增過(guò)程：
[0042]
[0043] 反應(yīng)終止后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化回收備用。
[0044]S20,利用QIAGEN的質(zhì)粒回收試劑盒，將相關(guān)細(xì)菌37 °C過(guò)夜培養(yǎng)后提取 pCR2.lc-TOPO質(zhì)粒，然后對(duì)提取的pCR2.lc-TOPO質(zhì)粒和步驟S10中擴(kuò)增得到的EGFP基因 分別進(jìn)行雙酶切（SacI/BamHI)處理，其中雙酶切體系如下：
[0045]
[0046] 總共100μ1，混勻后于37°C環(huán)境下酶切3h，然后通過(guò)1 %瓊脂糖凝膠電泳純化回 收待用；
[0047] 以及
[0048]
[0049] 總共100μ1，混勻后于37°C環(huán)境下酶切3h，然后通過(guò)1 %瓊脂糖凝膠電泳純化回 收待用；
[0050] 將上述電泳回收的雙酶切pCR2. lc-TOPO質(zhì)粒和EGFP片段進(jìn)行連接，體系如下：
[0051]
[0052] 總共20μ1，于16°C水浴中連接過(guò)夜得連接產(chǎn)物。
[0053]S21，制備感受態(tài)大腸桿菌DH5a，具體方法步驟可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (第三版）（2002,96-98,科學(xué)出版社）中介紹的步驟進(jìn)行；但是其中細(xì)胞懸浮液采用本發(fā)明 特異性研配的如下成分=88. 5%的TSS和11. 5%的80%甘油；其中TSS為：85mL滅菌處理 的LB液體培養(yǎng)基，10g聚乙二醇8000(PEG8000)，5mLDMS0,50mMMgC12,添加高壓滅菌水至 100mL后，用0. 45μm濾器過(guò)濾后,分裝于-20°C保存。
[0054] 進(jìn)一步將步驟S20得到的連接產(chǎn)物和上述感受態(tài)大腸桿菌DH5a進(jìn)行轉(zhuǎn)化，過(guò)程 如下：
[0055] 取10μ1步驟S20得到連接產(chǎn)物和50-100μ1制備的感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴 30min，42°C水浴熱激120秒，然后冰上放置5min;
[0056] 再加入LB培養(yǎng)基500μ1，置于37°C下，250rpm振搖培養(yǎng)60min。
[0057]S22,然后取步驟S21所得的200μ1重懸液涂布LB板上（含有50μg/mL卡那霉 素），倒置平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
[0058]S23,挑取S22進(jìn)行LB平板培養(yǎng)后的單一菌落，接種到含有50μg/mL卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
[0059]S24,從步驟S23中培養(yǎng)的菌體中抽提重組質(zhì)粒（可采用QIAGEN的質(zhì)?；厥赵噭?盒進(jìn)行），并分別做雙酶切（SacI/BamHI)鑒定和測(cè)序鑒定。
[0060]S30,分別采集SPF大鼠和試驗(yàn)用巴馬香豬的糞便樣品；
[0061] 將樣品進(jìn)行稀釋后，并涂在麥糠凱培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24小時(shí)；
[0062] 從麥糠凱培養(yǎng)基挑起典型的大腸桿菌菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)；
[0063] 并采用API20E試劑盒確證驗(yàn)證，結(jié)果為大腸桿菌；并根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分離的菌株 進(jìn)行抗生素敏感性測(cè)試。
[0064] 再分別挑選上述20株豬源和鼠源的敏感腸道大腸桿菌，制備感受態(tài)腸道大腸桿 菌，具體步驟可以參見(jiàn)上述步驟S21中感受態(tài)大腸桿菌DH5a的制備進(jìn)行。
[0065]S40,將感受態(tài)腸道大腸桿菌與步驟S24提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體取2μ1 步驟S24提取的重組質(zhì)粒和50-100μ1步驟S30制備的感受態(tài)腸道大腸桿菌，冰浴30min， 42°C水浴熱激120秒，然后冰上放置5min;
[0066] 再加入LB培養(yǎng)基500μ1，置于37°C下，250rpm振搖培養(yǎng)60min;
[0067] 轉(zhuǎn)化完成后篩選導(dǎo)入成功的腸道大腸桿菌即為本發(fā)明可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo) 記大腸桿菌。
[0068] 轉(zhuǎn)化完成后篩選導(dǎo)入成功的腸道大腸桿菌的步驟可以按照下述步驟進(jìn)行：
[0069] 然后分別取步驟S40中200μ1重懸液分別涂布：①LB板上（含有IPTG和卡那霉 素）；②LB板上（只含有卡那霉素）；
[0070] 涂布后倒置平板于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
[0071] 實(shí)施例2
[0072] 在上述實(shí)施例1中的制備過(guò)程步驟中，其采用的質(zhì)粒載體為pCR2.lc-TOPO質(zhì)粒， 在該實(shí)施例2中換成在質(zhì)粒pTrcHisB進(jìn)行，且制備過(guò)程中方法步驟不變，篩選步驟中LB 培養(yǎng)基中添加抗生素相應(yīng)換成氨芐青霉素，亦可得到本發(fā)明可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大 腸桿菌。
[0073] 當(dāng)然其中針對(duì)質(zhì)粒pTrcHisB采用的PCR引物包括：
[0076] 將上述實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌進(jìn)行驗(yàn) 證，如下：
[0077] 步驟S40轉(zhuǎn)化之后的篩選步驟的LB平板在可見(jiàn)光和紫外燈下觀察EGFP在平板上 菌落的表達(dá)情況可以參見(jiàn)圖1所示；都產(chǎn)生了比較良好的綠色熒光，EGFP均能很好地在動(dòng) 物腸道菌中進(jìn)行表達(dá)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pCR2.lc-TOPO-EGFP中的EGFP在沒(méi)有IPTG 誘導(dǎo)的情況下也能進(jìn)行表達(dá)，但這一現(xiàn)象卻沒(méi)有在重組質(zhì)粒pTrcHisB-EGFP中發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明 EGFP在質(zhì)粒pTrcHisB中能夠更好地受到控制。
[0078] 另外，額外對(duì)于實(shí)施例1中EGFP(重組質(zhì)粒pCR2. 1c-TOPO-EGFP)在大腸桿菌 DH5α中的表達(dá)情況進(jìn)行觀察，做了如下處理：將步驟22中過(guò)夜培養(yǎng)平板上挑選若干單一 菌落，接種到含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，待細(xì)菌生長(zhǎng)到0D600 = 0. 6左右時(shí)， 取lmL細(xì)菌懸浮液作為對(duì)照，然后在剩余的細(xì)菌懸浮液中加入ImMIPTG誘導(dǎo)3h，離心收集 沉淀，可見(jiàn)光下和紫外燈下分別觀察EGFP的表達(dá)情況。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，對(duì)照也呈現(xiàn)出微弱 的綠色熒光。以上結(jié)果在重復(fù)試驗(yàn)和不同動(dòng)物腸道分離菌中都有發(fā)現(xiàn)，明顯證明EGFP可穩(wěn) 定在動(dòng)物腸道菌中表達(dá)，并容易觀察。
[0079] 并進(jìn)一步驗(yàn)證，將以上步驟S24提取的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到分離到的各20株的大鼠腸道 大腸桿菌和豬腸道大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR2.lc-TOPO-EGFP可在3株大鼠腸道大腸桿菌中 穩(wěn)定表達(dá)（圖1)，和在5株豬腸道大腸桿菌主中穩(wěn)定表達(dá)。然而，只有各2株大鼠腸道大腸 桿菌和豬腸道大腸桿菌可穩(wěn)定表達(dá)PTrc