HisB-EGFP。IPTG可以很明顯地誘導(dǎo)EGFP在這些 菌中的表達(dá)。對這些標(biāo)記菌進(jìn)行超過10代的無選擇壓力的傳代，EGFP在這些菌中的表達(dá) 仍然穩(wěn)定。
[0080] 對上述實(shí)施例1和實(shí)施例2所獲得的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌體外培 養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示標(biāo)記菌的形態(tài)、生理測試指標(biāo)、生長指數(shù)以及生化指標(biāo)等都為正常并與原 菌相似，見圖2-3及下表1所示：
[0081] 表1 :具有pCR2. 1C-T0P0-EGFP的大鼠腸道大腸桿菌F1-GFP和豬腸道大腸桿菌 F2-GFP對不同抗生素的敏感度
[0082]
[0083] 并且進(jìn)一步將本發(fā)明上述可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌在動(dòng)物體內(nèi)的定 植和存活實(shí)驗(yàn)如下：
[0084] 為研究標(biāo)記菌定植情況，將實(shí)施例1獲得的熒光標(biāo)記大腸桿菌在LB肉湯培養(yǎng)過 夜，并分別取6份做試樣菌，分別為菌1-6 ;其中菌1、菌2取200微升灌胃大鼠，菌3及菌4 取1毫升灌胃大鼠，菌5及菌6取過夜肉湯20ml加入180ml超純水中混勻加入大鼠飲水器 中自由飲水。
[0085] 經(jīng)過6天的跟蹤試驗(yàn)，標(biāo)記菌2、3在一次性給菌后可從腸道內(nèi)分離到定植完好的 菌落；標(biāo)記菌1、4在一次性給菌兩天后，不能從腸道內(nèi)分離到，表明定植不成功；采用飲水 給菌的方法，可令標(biāo)記菌定植完好；結(jié)果見下表2。因此從方法上，飲水給菌的方式最適合 定植的進(jìn)行，且定植后的體內(nèi)標(biāo)記跟蹤持續(xù)性最佳。
[0086] 表2 :可定植動(dòng)物腸道的突光標(biāo)記大腸桿菌在大鼠體內(nèi)定植實(shí)驗(yàn)
[0089] 從本發(fā)明上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，本發(fā)明綜合利用綠色熒光蛋白和大腸桿菌的優(yōu)勢， 構(gòu)建出可穩(wěn)定在動(dòng)物腸道菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒pCR2.lc-TOPO-EGFP(弱控制型）和pTrcHis B-EGFP(可調(diào)控的強(qiáng)控制型），標(biāo)記的動(dòng)物腸道菌可用于示蹤研究，實(shí)時(shí)跟蹤檢測動(dòng)物腸道 菌在逆境環(huán)境下（如不同藥物處理）的變化或變異情況。
[0090] 當(dāng)然，除了上述進(jìn)一步應(yīng)用之外，本發(fā)明還能用于研究微生物在食品檢疫和環(huán)境 監(jiān)測等等以及可用于許多其他相關(guān)研究。
[0091] 在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種根據(jù)上述方法步驟制備得到的可定植動(dòng) 物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌。
[0092] 采用本發(fā)明的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌，工程菌構(gòu)建過程中采用原始 定植動(dòng)物腸道大腸桿菌作為基體，并采用pCR2.lc-TOPO或pTrcHisB作為載體，便于篩選 和在逆境環(huán)境下（比如不同藥物處理環(huán)境下）由于其本身具有良好的抗性使其更具優(yōu)良的 存活性，相比腸道大腸桿菌能夠具備更強(qiáng)競爭性，利于長久監(jiān)測掌握動(dòng)物腸道菌在逆境下 的動(dòng)態(tài)變異規(guī)律；并且其表達(dá)還可以通過所需跟蹤需求進(jìn)行控制和選擇。
[0093] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，包括如下步驟： PCR擴(kuò)增EGFP基因； 將所述PCR擴(kuò)增獲得的EGFP基因與環(huán)狀質(zhì)粒載體重組，得到重組質(zhì)粒；其中，所述環(huán)狀 質(zhì)粒載體為pCR2. lc-TOPO或pTrcHis B 獲取待定植動(dòng)物腸道的大腸桿菌，并進(jìn)行感受態(tài)處理后形成感受態(tài)腸道大腸桿菌； 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入至感受態(tài)腸道大腸桿菌，形成轉(zhuǎn)化工程菌，即為可定植動(dòng)物腸道的熒 光標(biāo)記大腸桿菌。2. 如權(quán)利要求1所述的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，其特征在于， 當(dāng)所述環(huán)狀質(zhì)粒載體為pCR2. lc-TOPO時(shí)，所述PCR擴(kuò)增EGFP基因在步驟中的PCR引物包 括上游引物T0P0-P1和下游引物T0P0-P2 ; 所述上游引物T0P0-P1具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列； 所述下游引物T0P0-P2具有序列表SEQ.ID.No.2的堿基序列； 當(dāng)所述環(huán)狀質(zhì)粒載體為pTrcHis B時(shí)，所述PCR擴(kuò)增EGFP基因在步驟中采用的PCR引 物包括上游引物TcrB-Pl和下游引物TcrB-P2 ; 所述上游引物TcrB-Pl具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列； 所述下游引物TcrB-P2具有序列表SEQ.ID.No. 4的堿基序列。3.如權(quán)利要求2所述的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，其特征在于， 將所述PCR擴(kuò)增獲得的EGFP基因與環(huán)狀質(zhì)粒載體重組步驟包括： 將所述PCR擴(kuò)增獲得的EGFP基因采用sac 1和BamHI進(jìn)行雙酶切處理； 將所述環(huán)狀質(zhì)粒載體采用sacl和BamHI進(jìn)行雙酶切處理； 將所述EGFP基因雙酶切產(chǎn)物和所述環(huán)狀質(zhì)粒載體雙酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接 處理，連接產(chǎn)物即為重組質(zhì)粒。4.如權(quán)利要求2所述的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，其特征在于， 將所述PCR擴(kuò)增獲得的EGFP基因與環(huán)狀質(zhì)粒載體重組步驟包括： 將所述PCR擴(kuò)增獲得的EGFP基因采用sacl和BamHI進(jìn)行雙酶切處理； 將所述環(huán)狀質(zhì)粒載體采用sacl和BamHI進(jìn)行雙酶切處理； 將所述EGFP基因雙酶切產(chǎn)物和所述環(huán)狀質(zhì)粒載體雙酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接 處理，得連接產(chǎn)物； 將大腸桿菌DH5 α進(jìn)行感受態(tài)處理后得感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，并將感受態(tài)大腸桿菌DH5a與所述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物； 將所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用含有抗生素的大腸桿菌培養(yǎng)基篩選，得到耐抗生素的大腸桿菌DH5 a;其中，當(dāng)所述環(huán)狀質(zhì)粒載體為pCR2.lc-TOPO時(shí)，所述抗生素為卡那霉素；所述環(huán)狀 質(zhì)粒載體為pTrcHis B時(shí)，所述抗生素為氨芐青霉素； 從所述耐抗生素的大腸桿菌DH5 α中抽提質(zhì)粒，并用雙酶切和基因測序鑒定篩選出攜 帶有目的EGFP基因的環(huán)狀質(zhì)粒載體，即為重組質(zhì)粒。5.如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，其 特征在于，將所述將重組質(zhì)粒導(dǎo)入至感受態(tài)腸道大腸桿菌，步驟包括： 從待定植動(dòng)物糞便樣品中獲取敏感大腸桿菌菌株，并進(jìn)行感受態(tài)處理后獲得感受態(tài)動(dòng) 物腸道大腸桿菌； 將攜帶有目的EGFP基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述感受態(tài)動(dòng)物腸道大腸桿菌，得轉(zhuǎn)化態(tài)動(dòng) 物腸道大腸桿菌； 將所述轉(zhuǎn)化態(tài)動(dòng)物腸道大腸桿菌用含有抗生素的大腸桿菌培養(yǎng)基篩選，得到耐抗生素 的動(dòng)物腸道大腸桿菌，即為可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌；其中，當(dāng)所述環(huán)狀質(zhì)粒載 體為pCR2.lc-TOPO時(shí)，所述抗生素為卡那霉素；所述環(huán)狀質(zhì)粒載體為pTrcHisB時(shí)，所述抗 生素為氨芐青霉素。6. 如權(quán)利要求1或4所述的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，其特征在 于，所述感受態(tài)處理過程中采用一步法，所述一步法中采用細(xì)胞懸浮液為：88. 5%的TSS和 11. 5%的80%甘油； 其中，所述TSS配方為：85mL滅菌LB液體培養(yǎng)基、10g聚乙二醇8000、5mLDMS0、50mM MgCl2，用高壓滅菌水至100mL。7. -種可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng) 所述的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法制得。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌制備方法，包括：PCR擴(kuò)增EGFP基因；將PCR擴(kuò)增獲得的EGFP基因與環(huán)狀質(zhì)粒載體重組，得到重組質(zhì)粒；獲取待定植動(dòng)物腸道的大腸桿菌，并進(jìn)行感受態(tài)處理后形成感受態(tài)腸道大腸桿菌；將重組質(zhì)粒導(dǎo)入至感受態(tài)腸道大腸桿菌，形成可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌。采用本發(fā)明的可定植動(dòng)物腸道的熒光標(biāo)記大腸桿菌，工程菌構(gòu)建過程中采用原始動(dòng)物腸道的大腸桿菌作為宿主，并采用pCR2.1c-TOPO或pTrcHis？B作為載體便于篩選，以及在逆境環(huán)境下其本身具有良好的抗性使其更具優(yōu)良的存活性，相比其他腸道大腸桿菌具備更強(qiáng)的競爭性，并利于長久監(jiān)測掌握動(dòng)物腸道菌在逆境下的動(dòng)態(tài)變異規(guī)律；而且還可以根據(jù)跟蹤需求控制其表達(dá)。
【IPC分類】C12N1/21, C12R1/19, C12N15/63
【公開號】CN105462906
【申請?zhí)枴緾N201410462647
【發(fā)明人】陳聲, 郭九標(biāo), 林大川, 黃浩賢
【申請人】香港理工大學(xué)深圳研究院
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2014年9月11日