。[0031 ] 3、pYA4278_cpsG自殺質(zhì)粒的構(gòu)建
將融合片段進行加A(A堿基)處理。利用天根生化科技有限公司的plus A反應(yīng)試劑盒，反應(yīng)體系為:模板15 yL，plus A buffer 4 yL，Taq酶1 yL;反應(yīng)條件為:72°C 30min。
自殺質(zhì)粒PYA4278酶切片段的準備:過夜培養(yǎng)含pYA4278質(zhì)粒的宿主菌，取4 ml菌液，利用天根生化科技有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取，最后用50 ul的ddH20進行洗脫，在加6 ul的NEB CutSmart 10X buffer和1 ul的Ahd I酶進行酶切，回收載體PYA4278。
[0032]將加A處理的融合片段與經(jīng)酶切后的pYA4278質(zhì)粒用T4 DNA ligase連接，16°C水浴過夜，轉(zhuǎn)化進Apir大腸桿菌感受態(tài)細胞，待其長出后進行PCR鑒定，獲得陽性重組自殺質(zhì)粒pYA4278-cpsG。將質(zhì)粒抽提后送往上海英俊生物技術(shù)有限公司進行測序，證實構(gòu)建的自殺質(zhì)粒是正確的。
[0033]4、S100 AcpsG突變株的構(gòu)建與鑒定
將構(gòu)建好的重組自殺質(zhì)粒pYA4278-cpsG轉(zhuǎn)化至Apir大腸桿菌菌株中(該菌株缺失了asd基因，需要DAP才能夠生長，用于后續(xù)接合轉(zhuǎn)移的篩選)，將攜帶有自殺質(zhì)粒pYA4278-cpsG的Apir大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌S100進行接合轉(zhuǎn)移，在氯霉素抗性的LB平板上篩選陽性菌落，將陽性菌落在不含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖，最后稀釋涂10%的蔗糖板，在10%蔗糖平板上篩選耐蔗糖菌落，并挑取單菌落進行PCR鑒定。
[0034]PCR鑒定:以待檢菌落為模板，用引物DcpSG-lF/DcpSG-2R進行PCR擴增。菌株缺失cpsG后，引物DcpsG-lF/DcpsG-2R擴增產(chǎn)物大小即為上下游同源臂融合的大小(759 bp)。若未缺失成功則PCR產(chǎn)物條帶大小為2218 bp。結(jié)果，缺失株P(guān)CR鑒定條帶大小與理論相符，如圖1B。表明cpsG基因缺失株構(gòu)建成功。將突變株命名為S100 Δ cpsG。
[0035]實施例3
1、Δ rfbM引物設(shè)計
根據(jù)NCBI Genbank公布的鼠傷寒沙門氏菌UK-1全基因組序列(序列號:CP002614)，設(shè)計兩對引物分別擴增rfbM基因的上、下游同源臂，擴增片段大小分別為495 bp,440 bp，上述引物均由北京華大基因公司合成，引物序列如下:
DrfbM-lF: 5’ GCTGCCTATCGCCGTTCCG 3’
DrfbM-lR: 5 ’GGTGCGCCCAATCCAGCCGCCAGCCATAATTACGGGAAGAAAAGACAT 3，
D rfbM-2F: 5'TGGATTGGGCGCACCCGTTCTGGATTTTCGAAGGAGTGGAC 3’
D rfbM-2R: 5’ GGATCGCAGCCTCATCATG 3’2、rfbK基因的上、下游同源臂的擴增以及融合
挑取鼠傷寒沙門氏菌S100單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(37°C，180rpm)，用天根生化科技有限公司的細菌基因組抽提試劑盒，按照說明書的操作步驟進行基因組抽提。
[0036]PCR擴增反應(yīng)在20 yL的體系中進行，反應(yīng)體系如下:模板DNA 0.4 yL，2XprimeSTAR Max(寶生物有限公司)10 yL，上游引物0.4 yL，下游引物0.4 yL，ddH20 8.8 μ
L0
[0037]擴增條件為:98°C變性2 min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為98°C 10 sec,55°C 15 sec,72°C 30 secJO個循環(huán)后，72°C延伸5min。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增兩個片段大小分別為495 bp和440 bp，與預(yù)期大小相符。
[0038]上、下游同源臂的融合:用天根生化科技有限公司的DNA純化回收試劑盒，將上下游同源臂的產(chǎn)物混合后進行PCR液回收，以上述回收產(chǎn)物為模板，利用引物DrfbM-lF和DrfbM-2R在與之前相同體系以及擴增條件下進行擴增，得到大小為900bp左右的融合片段。
[0039]3、pYA4278_rfbM自殺質(zhì)粒的構(gòu)建
將融合片段進行加A(A堿基)處理。利用天根生化科技有限公司的plus A反應(yīng)試劑盒，反應(yīng)體系為:模板15 yL，plus A buffer 4 yL，Taq酶1 yL;反應(yīng)條件為:72°C 30min。
自殺質(zhì)粒PYA4278酶切片段的準備:過夜培養(yǎng)含pYA4278質(zhì)粒的宿主菌，取4 ml菌液，利用天根生化科技有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取，最后用50 ul的ddH20進行洗脫，在加6 ul的NEB CutSmart 10X buffer和1 ul的Ahd I酶進行酶切，回收載體PYA4278。
[0040]將加A處理的融合片段與經(jīng)酶切后的pYA4278質(zhì)粒用T4 DNA ligase連接，16°C水浴過夜，轉(zhuǎn)化進Apir大腸桿菌感受態(tài)細胞，待其長出后進行PCR鑒定，獲得陽性重組自殺質(zhì)粒pYA4278-rfbM。將質(zhì)粒抽提后送往上海英俊生物技術(shù)有限公司進行測序，證實構(gòu)建的自殺質(zhì)粒是正確的。
[0041 ] 4、S100 Δ rfbM突變株的構(gòu)建與鑒定
將構(gòu)建好的重組自殺質(zhì)粒pYA4278-rfbM轉(zhuǎn)化至Apir大腸桿菌菌株中(該菌株缺失了asd基因，需要DAP才能夠生長，用于后續(xù)接合轉(zhuǎn)移的篩選)，將攜帶有自殺質(zhì)粒pYA4278-rfbM的Apir大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌S100進行接合轉(zhuǎn)移，在氯霉素抗性的LB平板上篩選陽性菌落，將陽性菌落在不含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖，最后稀釋涂10%的蔗糖板，在10%蔗糖平板上篩選耐蔗糖菌落，并挑取單菌落進行PCR鑒定。
[0042]PCR鑒定:以待檢菌落為模板，用引物DrfbM-lF/DrfbM_2R進行PCR擴增。菌株缺失rfbM后，引物DrfbM-lF/DrfbM-2R擴增產(chǎn)物大小即為上下游同源臂融合的大小(935 bp)。若未缺失成功則PCR產(chǎn)物條帶大小為2273 bp。結(jié)果，缺失株P(guān)CR鑒定條帶大小與理論相符，表明rfbM基因缺失株構(gòu)建成功。將突變株命名為S100 &^1^，如圖3八。
[0043]實施例4
1、Δ cpsB引物設(shè)計
根據(jù)NCBI Genbank公布的鼠傷寒沙門氏菌UK-1全基因組序列(序列號為:CP002614)，設(shè)計兩對引物分別擴增cpsB基因的上、下游同源臂，擴增片段大小分別為469 bp、444bp，上述引物均由北京華大基因公司合成，引物序列如下:
DcpsB-lF: 5’ CGCGGAACGATTACGCGATCG 3’
DcpsB-lR: 5’CGGCTTATCCGTAGGACGTCATCCCCGAATATCTGCAATAAATTGGCG 3’
DcpsB-2F: 5’CGTCCTACGGATAAGCCGCGCCTGCAATTATGCCCGGTAAGC 3’
DcpsB-2R: 5’ CGCGCACCAGCTTCATACCG 3’ 2、cpsB基因的上、下游同源臂的擴增以及融合
挑取鼠傷寒沙門氏菌S100單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(37°C，180rpm)，用天根生化科技有限公司的細菌基因組抽提試劑盒，按照說明書的操作步驟進行基因組抽提。
[0044]PCR擴增反應(yīng)在20 yL的體系中進行，反應(yīng)體系如下:模板DNA 0.4 yL，2XprimeSTAR Max(寶生物有限公司)10 yL，上游引物0.4 yL，下游引物0.4 yL，ddH20 8.8 μ
L0
[0045]擴增條件為:98°C變性2 min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為98°C 10 sec，55°C 15 sec，72°C 30 secJO個循環(huán)后，72°C延伸5min。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增兩個片段大小分別為469 bp和444 bp，與預(yù)期大小相符。
[0046]上、下游同源臂的融合:用天根生化科技有限公司的DNA純化回收試劑盒，將上下游同源臂的產(chǎn)物混合后進行PCR液回收，以上述回收產(chǎn)物為模板，利用引物DcpsB-lF和DcpsB-2R在與之前相同體系以及擴增條件下進行擴增，得到大小為913bp左右的融合片段。
[0047]3、pYA4278_cpsB自殺質(zhì)粒的構(gòu)建
將融合片段進行加A(A堿基)處理。利用天根生化科技有限公司的plus A反應(yīng)試劑盒，反應(yīng)體系為:模板15 yL，plus A buffer 4 yL，Taq酶1 yL;反應(yīng)條件為:72°C 30min。
自殺質(zhì)粒PYA4278酶切片段的準備:過夜培養(yǎng)含pYA4278質(zhì)粒的宿主菌，取4 ml菌液，利用天根生化科技有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒提取，最后用50 ul的ddH20進行洗脫，在加6 ul的NEB CutSmart 10X buffer和1 ul的Ahd I酶進行酶切，回收載體PYA4278。
[0048]將加A處理的融合片段與經(jīng)酶切后的pYA4278質(zhì)粒用T4 DNA ligase連接，16°C水浴過夜，轉(zhuǎn)化進Apir大腸桿菌感受態(tài)細胞，待其長出后進行PCR鑒定，獲得陽性重組自殺質(zhì)粒pYA4278-cpsB。將質(zhì)粒抽提后送往上海英俊生物技術(shù)有限公司進行測序，證實構(gòu)建的自殺質(zhì)粒是正確的。
[0049]4、S100 AcpsB突變株的構(gòu)建與鑒定
將構(gòu)建好的重組自殺質(zhì)粒pYA4278-cpsB轉(zhuǎn)化至Apir大腸桿菌菌株中(該菌株缺失了asd基因，需要DAP才能夠生長，用于后續(xù)接合轉(zhuǎn)移的篩選)，將攜帶有自殺質(zhì)粒pYA4278-cpsB的Apir大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌S100進行接合轉(zhuǎn)移，在氯霉素抗性的LB平板上篩選陽性菌落，將陽性菌落在不含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖，最后稀釋涂10%的蔗糖板，在10%蔗糖平板上篩選耐蔗糖菌落，并挑取單菌落進行PCR鑒定。
[0050]PCR鑒定:以待檢菌落為模板，用引物DcpSB-lF/DcpSB-2R進行PCR擴增。菌株缺失cpsB后，引物DcpsB-lF/DcpsB-2R擴增產(chǎn)物大小即為上下游同源臂融合的大小(913 bp)。若未缺失成功則PCR產(chǎn)物條帶大小為2352 bp。結(jié)果，缺失株P(guān)CR鑒定條帶大小與理論相符，如圖3B。表明cpsB基因缺失株構(gòu)建成功。將突變株命名為S100 Δ cpsB。
[0051 ] 實施例5
減毒鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typimurium S116的構(gòu)建與鑒定將攜帶有自殺質(zhì)粒pYA4278-cpsG的Apir大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌S100 Δ rfbK進行接合轉(zhuǎn)移，在氯霉素抗性的LB平板上篩選陽性菌落，將陽性菌落在不含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖，在10%蔗糖平板上篩選耐蔗糖菌落，并挑取單菌落進行PCR鑒定。
[0052]PCR鑒定:以待檢菌落為模板，用引物DrfbK-lF/DrfbK-2R和DcpsG-lF/DcpsG-2R進行PCR擴增。菌株缺失rf bK后，引物Drf bK-lF/Drf bK-2R擴增產(chǎn)物大小即為上下游同源臂融合的大小(802 bp)，若未缺失成功則PCR產(chǎn)物