條帶大小為2273 bp;菌株缺失cpsG基因后，弓丨物DcpSG-lF/DcpSG-2R擴(kuò)增產(chǎn)物大小即為上下游同源臂融合的大小(759 bp)。若未缺失成功則PCR產(chǎn)物條帶大小為2218 bpWCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖電泳，缺失株條帶大小與理論相符，如圖1C。表明rfbK、cpsG基因雙缺失株構(gòu)建成功，將突變株命名為Salmonellatypimurium SI16 。
[0053]實(shí)施例6
缺失rfbM和cpsB基因突變株的構(gòu)建與鑒定
將攜帶有自殺質(zhì)粒pYA4278-cpsB的Apir大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌S100 Δ rfbM進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，在氯霉素抗性的LB平板上篩選陽(yáng)性菌落，將陽(yáng)性菌落在不含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖，在10%蔗糖平板上篩選耐蔗糖菌落，并挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。
[0054]PCR鑒定:以待檢菌落為模板，用引物DrfbmM-lF/DrfbM-2R和DcpsB-lF/DcpsB-2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。菌株缺失rfbM后，引物DrfbM-lF/DrfbM-2R擴(kuò)增產(chǎn)物大小即為上下游同源臂融合的大小(935 bp)，若未缺失成功則PCR產(chǎn)物條帶大小為2300 bp;菌株缺失cpsG基因后，引物DcpsB-lF/DcpsB-2R擴(kuò)增產(chǎn)物大小即為上下游同源臂融合的大小(913 bp)。若未缺失成功則PCR產(chǎn)物條帶大小為2352 bpWCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖電泳，缺失株條帶大小與理論相符，如圖3C。表明rfbM、cpsB基因雙缺失株構(gòu)建成功，將突變株命名為S100 ( Δ rfbM ΔcpsB) ο
[0055]實(shí)施例7
l.rfbK、cpsG基因缺失株LPS表型圖譜
樣品處理:分別挑取野生株S100和突變株S100( ArfbK)、S100( ACpSG)和S100( ArfbKA cpsG)單菌落于3 mL液體LB中過(guò)夜培養(yǎng)，次日，菌液測(cè)0D6Q()以后，分別取相等量的菌體(一般取0D_為1時(shí)，1 mL菌液里的菌體量)于EP管中，離心(4000 rpm，10 min)，倒掉上清，用PBS重懸菌體，再離心，重復(fù)洗滌2次。向各個(gè)EP管中加入150 yL細(xì)菌裂解液，重懸并裂解菌體。煮沸10 min后，冷卻至室溫，離心(12,000 rpm, 10 min)。取上清10 yL加入含90 yL上樣緩沖液的EP管中，再向各個(gè)EP管中加入lyL蛋白酶K，充分混勻后，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育lh0
[0056]SDS-GAGE:按配方進(jìn)行12.5%的分離膠和5%的濃縮膠制備后，按菌株5100、5100(八rfbK)、S100(ACpSG)、S100(Δ rfbKΔcpsG)、S100(Δ rfbK(pl5a_rfbK))、S100(Δ rfbK(pl5a_cpsG))、S100( Δ rfbK Δ cpsG(pl5a_rfbK))、S100( Δ rfbK Δ cpsG(pl5a_cpsG))的上樣順序，向孔中加入10 yL樣品，向多余的孔中加入等量的上樣緩沖液，以80V電壓電泳20min后改為120V至電泳完畢。
[0057]銀染:將SDS-PAGE后的膠按以下順序進(jìn)行處理。固定:向干凈的燒杯中加入200 mL新鮮配制的固定液，再將PAGE后的膠放入燒杯中，用保鮮膜封口后，置于水平搖床上固定4h;氧化:將固定液倒掉后，往燒杯中加入新鮮配制的氧化液，置于水平搖床搖動(dòng)7 min;漂洗:倒掉氧化液，用200 mL超純水洗滌3次，15 min/次;銀染:將新鮮配制的銀染液加入燒杯中，水平搖床搖動(dòng)10 min;漂洗:倒掉銀染液，用用200 mL超純水洗滌3次，15 min/次;顯影:將新鮮配制的顯影液加入燒杯中，置于水平搖床，邊搖動(dòng)邊觀察，至到條帶顯影;終止:倒掉顯影液，加入200 mL超純水終止顯影;照相:將膠取出，放置于凝膠成像系統(tǒng)中照相保存。
[0058]Western-blot—轉(zhuǎn)膜(半干轉(zhuǎn)印法):電泳后，將膠取出，置于玻璃板上，測(cè)量大小后，將其侵泡于裝有轉(zhuǎn)膜液的玻璃皿中。然后根據(jù)膠的長(zhǎng)度和寬度剪裁厚濾紙和PVDF膜，將剪裁后的PVDF膜侵泡甲醇1-2 min，濾紙侵泡于轉(zhuǎn)膜液中。按從下到上的順序依次疊放:濾紙、PVDF膜、膠、濾紙。最后，將其放入轉(zhuǎn)膜儀中進(jìn)行10V恒壓轉(zhuǎn)膜30 min;封閉:將PVDF膜取出，置于玻璃皿中，用1XTBST淌洗3次后，加入新鮮配制的封閉液，置于4°C，封閉過(guò)夜；洗滌:次日，將封閉液回收后，向玻璃皿中加入適當(dāng)體積的1 X TBST，室溫振蕩漂洗3次，10min/次;孵育一抗:向5 mL封閉液(3% BSA)中按1: 200比例加入沙門氏菌兔源04血清，混勻后將其倒入樣品袋中，再將洗滌后的PVDF膜放入樣品袋中，排出氣泡后，將樣品袋封口，置于水平搖床上，室溫孵育1 h。洗滌后孵育二抗:向5 mL 1XTBST中按1:20000的比例加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，與膜共孵育lh。洗滌后，孵育AP標(biāo)記的鏈霉親和素:向5 mL 1X TBST中按1:1000的比例加入AP標(biāo)記的鏈霉親和素，與膜共孵育1 h。洗滌后進(jìn)行顯色:取出PVDF膜，置于玻璃皿中。將顯色劑1XAP 13時(shí)€6廣4液、8液按1000 yL、50 yL、50 yL的體積加入EP管中混勻后，滴加到PVDF膜上，避光顯色至致條帶顯現(xiàn)。照相:將終止顯色的PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中，照相保存結(jié)果。
[°°59] 以上銀染和western結(jié)果分別如圖2A和213所示。表明cpsG基因的缺失并不影響LPS的合成，rfbK基因的缺失對(duì)LPS的合成影響較大，但并不能完全阻斷其合成，見(jiàn)圖2B，而rfbK和cpsG基因的同時(shí)缺失，則可完全阻斷LPS的合成。
[0060]2.rfbM、cpsB基因缺失株LPS表型圖譜
樣品處理:分別挑取野生株S100和突變株S100( ArfbM)、S100( AcpsB)和S100( ArfbMA cpsB)單菌落于3 mL液體LB中過(guò)夜培養(yǎng)，次日，菌液測(cè)0D6Q()以后，分別取相等量的菌體(一般取0D_為1時(shí)，1 mL菌液里的菌體量)于EP管中，離心(4000 rpm，10 min)，倒掉上清，用PBS重懸菌體，再離心，重復(fù)洗滌2次。向各個(gè)EP管中加入150 yL細(xì)菌裂解液，重懸并裂解菌體。煮沸10 min后，冷卻至室溫，離心(12,000 rpm, 10 min)。取上清10 yL加入含90 yL上樣緩沖液的EP管中，再向各個(gè)EP管中加入lyL蛋白酶K，充分混勻后，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育
lho
[0061]SDS-GAGE:按配方進(jìn)行12.5%的分離膠和5%的濃縮膠制備后，按菌株5100、5100(八cpsB)、S100( Δ rfbM)、S100( Δ rfbM Δ cpsB)、S100( Δ rfbM Δ cpsB(pl5a_cpsG))、的上樣順序(銀染順序)或按菌株S100、S100( Δ rfbM)、S100( Δ cpsB)、S100( Δ rfbM Δ cpsB)、S100( ΔrfbMA cpsB(pl5a-cpsG))的上樣順序(western順序)，向孔中加入10 yL樣品，向多余的孔中加入等量的上樣緩沖液，以80V電壓電泳20 min后改為120V至電泳完畢。
[0062]銀染:將SDS-PAGE后的膠按以下順序進(jìn)行處理。固定:向干凈的燒杯中加入200 mL新鮮配制的固定液，再將PAGE后的膠放入燒杯中，用保鮮膜封口后，置于水平搖床上固定4h;氧化:將固定液倒掉后，往燒杯中加入新鮮配制的氧化液，置于水平搖床搖動(dòng)7 min;漂洗:倒掉氧化液，用200 mL超純水洗滌3次，15 min/次;銀染:將新鮮配制的銀染液加入燒杯中，水平搖床搖動(dòng)10 min;漂洗:倒掉銀染液，用用200 mL超純水洗滌3次，15 min/次;顯影:將新鮮配制的顯影液加入燒杯中，置于水平搖床，邊搖動(dòng)邊觀察，至到條帶顯影;終止:倒掉顯影液，加入200 mL超純水終止顯影;照相:將膠取出，放置于凝膠成像系統(tǒng)中照相保存。
[0063]Western-blot—轉(zhuǎn)膜(半干轉(zhuǎn)印法):電泳后，將膠取出，置于玻璃板上，測(cè)量大小后，將其侵泡于裝有轉(zhuǎn)膜液的玻璃皿中。然后根據(jù)膠的長(zhǎng)度和寬度剪裁厚濾紙和PVDF膜，將剪裁后的PVDF膜侵泡甲醇1-2 min，濾紙侵泡于轉(zhuǎn)膜液中。按從下到上的順序依次疊放:濾紙、PVDF膜、膠、濾紙。最后，將其放入轉(zhuǎn)膜儀中進(jìn)行10V恒壓轉(zhuǎn)膜30 min;封閉:將PVDF膜取出，置于玻璃皿中，用1XTBST淌洗3次后，加入新鮮配制的封閉液，置于4°C，封閉過(guò)夜；洗滌:次日，將封閉液回收后，向玻璃皿中加入適當(dāng)體積的1 X TBST，室溫振蕩漂洗3次，10min/次;孵育一抗:向5 mL封閉液(3% BSA)中按1: 200比例加入沙門氏菌兔源04血清，混勻后將其倒入樣品袋中，再將洗滌后的PVDF膜放入樣品袋中，排出氣泡后，將樣品袋封口，置于水平搖床上，室溫孵育1 h。洗滌后孵育二抗:向5 mL 1XTBST中按1:20000的比例加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，與膜共孵育lh。洗滌后，孵育AP標(biāo)記的鏈霉親和素:向5 mL 1X TBST中按1:1000的比例加入AP標(biāo)記的鏈霉親和素，與膜共孵育1 h。洗滌后進(jìn)行顯色:取出PVDF膜，置于玻璃皿中。將顯色劑1XAP 13時(shí)€6廣4液、8液按1000 yL、50 yL、50 yL的體積加入EP管中混勻后，滴加到PVDF膜上，避光顯色至致條帶顯現(xiàn)。照相:將終止顯色的PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)中，照相保存結(jié)果。
[0064]以上銀染和western結(jié)果分別如圖3A和313所示。表明cpsB基因的缺失并不影響LPS的合成，rfbM基因的缺失對(duì)LPS的合成影響較大，但并不能完全阻斷其合成，見(jiàn)圖3B，而rfbM和cpsB基因的同時(shí)缺失，則可完全阻斷LPS的合成。
[0065]實(shí)施例8
S100 Δ rfbK; Salmonella typimurium S116 的回補(bǔ)及表型鑒定
1.引物設(shè)計(jì)
根據(jù)NCBI Genbank公布的鼠傷寒沙門氏菌UK-1全基因組序列(序列號(hào)為:CP002614)，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增rfbK和cpsG基因，擴(kuò)增片段大小分別為1445 bp、1374bp，上述引物均由北京華大基因公司合成，引物序列如下:
rfbK-F-BamHI:5， CGCGGATCCTGAACGTAGTTAATAATAGC3，rfbK -R-Pstl:5’ ATCCTGCAGTCAATTTTTTTACAGCAAGC3’cpsG-F-BamH1:5’ CGCGGATCCTGACAAAATTAACCTGTTTC 3’cpsG-R-Pstl:5’ ATCCTGCAGGACGTTACTGATTCAGCAGC3’
2.回補(bǔ)質(zhì)粒pl5a_rfbK^Ppl5a- cpsG的構(gòu)建
以野生株S100基因組為模板，分別用引物rfbK-F-BamHI / rfbK -R-PstI和cpsG_F-BamHI / cpsG-R-Pstl擴(kuò)rfbK基因和cpsG基因。將擴(kuò)增回收的rfbK和cpsG基因片段與低拷貝質(zhì)粒pl5a用限制性內(nèi)切酶BamH 1、PstI進(jìn)行雙酶切。將酶切后rfbK和cpsG基因片段與酶切后質(zhì)粒pl5a用T4 DNA ligase連接，16°C水浴過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，待其長(zhǎng)出后進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pl5a- rfbK和pl5