一種番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]番前是一種重要的蔬菜作物，近年來受到番前黃化曲葉病毒(Tomatoyello wleaf curl virus，TYLCV)病的危害，使我國番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到了嚴重的影響。該病害由攜帶番茄黃化葉病毒的煙粉虱進行傳播，由于栽培番茄中起初都不含有抗病基因，植株被TYLCV侵染后，生長受到嚴重抑制，易落花落果。如果苗期感病，危害嚴重時，甚至造成絕產(chǎn)絕收，對番茄生產(chǎn)造成了巨大的影響。而在野生番茄中發(fā)現(xiàn)的抗TYLCV基因，經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)，對該病具有很好的抗性。
[0003 ]已知的番茄抗 TYLCV 基因有，Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty_3a，Ty-4，Ty_5 和 Ty_6。在我國的番茄品種中應(yīng)用較多的抗病基因是Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a。由于TYLCV變異性強，長期使用現(xiàn)有抗原容易使病毒突破抗病基因的抗性。在番茄抗TYLCV育種過程中，選育含有多個抗TYLCV基因的品種，可以顯著的增強品種的抗性水平。但在對這些基因進行聚合育種的過程中，分離群體抗性鑒定后，所獲得的抗TYLCV植株無法確定其中含有的是哪個抗性基因。利用分子標(biāo)記的手段，可以對鑒定后抗性材料中的抗病基因進行標(biāo)記確定，甚至可以不通過抗性鑒定，就能判斷植株中所含的是哪個抗病基因，加快了對育種材料的選擇，縮短了育種的進程?；谏鲜鲈颍景l(fā)明提供一種可以同時對材料中是否含有Ty-3和ty-5進行鑒定的多重PCR方法，這對于利用分子標(biāo)記輔助育種的手段同時對這兩個基因番茄材料進行育種工作具有重要的意義。目前，Ty-3基因被定位在番茄6號染色體長臂端，標(biāo)記P6-25與該基因連鎖。圖位克隆確定該基因與Ty-Ι為等位基因，均為RNA依賴性的RNA聚合酶。ty-5基因被定位在番茄4號染色體上，與CAPS標(biāo)記S1NAC1連鎖，該標(biāo)記也是目前已知的唯一與ty-5連鎖的分子標(biāo)記。
[0004]雖然利用Ty-3和ty-5的分子標(biāo)記進行輔助選擇可以加快對含有基因材料的篩選，但是需要進行兩輪PCR檢測才能完成對材料的篩選，如果可以建立這兩個基因的多重PCR體系，可以在原來的基礎(chǔ)上將工作效率提高一倍，鑒定成本減少一半，更加有利于對抗病基因的篩選。但目前的Ty-3基因的連鎖標(biāo)記經(jīng)過分析后，由于標(biāo)記類型和內(nèi)切酶的差異，均無法與ty-5基因建立多重PCR體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，用于快速鑒定番茄材料中是否含有番茄黃化曲葉病抗性基因Ty-3和ty-5，有利于對這兩個基因進行聚合育種時，對抗病基因材料的篩選。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0007]—種番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，其包括以下步驟:
[0008]1)從番茄葉中提取待檢測番茄葉片DNA;
[0009]2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty-3和ty-5的引物，通過建立的多重PCR反應(yīng)體系，對待測樣品進行多重PCR擴增；
[0010]3)PCR產(chǎn)物電泳檢測；
[0011]4)對待測番茄樣品中是否含有Ty-3基因和ty-5基因進行鑒定。
[0012]進一步的方案，本發(fā)明所述的步驟1)中的番茄葉取自育種、野生、分離群體番茄品種的番茄葉。
[0013]進一步的方案，本發(fā)明所述的步驟2)中，
[0014]Ty-3 引物為:
[0015]P6-25-F2:GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC
[0016]P6-25-R5:GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC；
[0017]ty-5 引物為:
[0018]ty5-17R:TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0019]ty5-17F:GTCTCCGAAACGTAATCC。
[0020]進一步的方案，本發(fā)明所述的步驟2)中，多重PCR反應(yīng)體系為:
[0021]lOng/yL模板DNA 2yL,
[0022]4pmmol/L 的引物對 P6-25-F2/P6-25-R5 與 ty5_17R/F 各 0.5yL，
[0023]mix 酶 10yL，
[0024]雙蒸水或三蒸水加至20yL;
[0025]多重PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min;每個循環(huán)95°C變性45sec，51°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0026]進一步的方案，本發(fā)明所述的步驟3)中，電泳采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，電泳的具體步驟包括:
[0027]a)制備聚丙烯酰胺凝膠:Κ0Η溶液浸泡玻璃板一定時間，用去污劑和清水清洗干凈，最后用雙蒸水沖洗，晾干后用乙醇擦拭長短板;然后將長板處理面向上，短板處理面向下蓋到長板上，用橡膠條固定兩個板，插入垂直電泳儀支架，短板向里固定，即凹口板面向電泳液方向，用1 %的瓊脂糖密封橡膠條與玻璃板之間的縫隙；在30%的丙烯酰胺溶液加入10 X TBE、雙蒸水、TEMED以及10 %的APS配置成8 %的聚丙烯酰胺溶液;然后將電泳槽傾斜30度，緩緩地使聚丙烯酰胺溶液倒入兩板間，等膠溶液快要溢出時，把玻璃板放平，用薄塑料板趕氣泡，倒插梳子;灌完膠后，放于室溫讓其自然凝固，觀察膠邊沿出現(xiàn)折射線就表明膠已凝固；
[0028]b)聚丙烯酰胺凝膠電泳:向電泳儀下端槽內(nèi)倒ΙχΤΒ，向上槽倒1XTBE，使液面高于短板上沿，拔出梳子，并用注射器吸取適量電泳液把點樣孔洗干凈;取PCR產(chǎn)物上樣;調(diào)節(jié)電壓160V，電泳1.5-2.0h，電泳完畢；
[0029]c)聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色:把經(jīng)冷卻的膠板置于盛有固定液的塑料盤中，搖床震蕩3_8min;然后將膠板置于盛有染色液的塑料盤中，搖床震蕩10-15min;經(jīng)染色的膠板用雙蒸水清洗，然后用添加了濃度為10 %的Na2S203的雙蒸水清洗;將清洗干凈的膠板置于顯色液中顯色，至DNA條帶清晰后將顯色完畢的膠板放回固定液中反應(yīng)，反應(yīng)完成后用雙蒸水清洗，然后用保鮮膜密封，置于室溫自然干燥，條帶統(tǒng)計、拍照留存。
[0030]進一步的方案，本發(fā)明所述的固定液由0.5 %乙酸2.5mL、10 %乙醇50mL、雙蒸水450mL組成;所述染色液由硝酸銀與雙蒸水組成，其中硝酸銀與雙蒸水的質(zhì)量比為1:500。
[0031]進一步的方案，本發(fā)明所述的所述顯色液由7.5g Na0H、37%-40%的甲醛1.5mL、雙蒸水500mL組成。
[0032]進一步的方案，本發(fā)明所述的步驟4)中，對待測樣品中Ty-3基因和ty-5基因進行鑒定方法具體步驟為:在步驟3)酶切后的多態(tài)性條帶中大找出750bp和172bp條帶，即分別對應(yīng)Ty-3基因和ty-5基因。
[0033]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:
[0034]1本發(fā)明所述的番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法可以用于對番茄材料和群體中是否含有Ty-3基因和ty-5基因這兩個基因進行快速鑒定，加快了對分子標(biāo)記輔助選擇的進程，縮短了育種周期，降低了育種成本；
[0035]2本發(fā)明所述的番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法克服了對兩個基因分離群體進行抗性鑒定后無法確定含有哪個抗病基因的困擾；
[0036]3.本發(fā)明所述的番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法可降低生產(chǎn)過程中化學(xué)農(nóng)藥的施用，減輕病害的傳播流行，節(jié)約生產(chǎn)成本，保障番茄生產(chǎn)的順利開展，提高番茄產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益；
[0037]4.本發(fā)明所述的番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法效率高，使用成本低，有利于抗病基因材料的篩選。
【附圖說明】
[0038]圖1為Ty-3和ty-5檢測電泳圖譜；其中Μ: lOObp Marker; 1、2、3分別代表P6-25以99S-C、moneymaker 和FI (99S-C X moneymaker)為模板擴增結(jié)果;4、5、6分別代表ty5_17以1227、moneymaker和F1 (1227 Xmoneymaker)為模板擴增結(jié)果;7代表多重PCR體系以F1 (1227X99S-C)為模板擴增結(jié)果。
[0039]圖2為F2(1227X99S-C)分離后代多重PCR檢測電泳圖譜；其中M:100bp Marker; 1-20代表20株隨機的F2( 1227 X 99S-C)分離單株經(jīng)多重PCR擴增后電泳結(jié)果。
【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0041 ] 一種番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測方法，其包括以下步驟:
[0042]1)提取待檢測番茄葉片DNA;
[0043]2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty-3和ty-5的引物，通過建立的多重PCR反應(yīng)體系，對待測樣品進行多重PCR擴增；
[0044]其中多重PCR的反應(yīng)體系為:
[0045]lOng/yL模板DNA 2yL,
[0046]4pmmol/L 的引物對 P6-25-F2/P6-25-R5 與 ty5_17R/F 各 0.5yL，
[0047]mix 酶 10yL，
[0048]雙蒸水或三蒸水加至20yL;
[0049]PCR反應(yīng)體系中所用引物為:
[0050] P6-25-F2:GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC[0051 ] P6-25-R5:GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC
[0052]ty5-17R:TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0053]ty5-17F:GTCTCCGAAACGTAATCC；
[0054]多重PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min;每個循環(huán)95°C變性45sec，51°C退火45sec，72°C延伸45sec，共3