lane6，172bp和 187bp ；利用多重PCR體系對(duì)FI (1227 X 99S-C)進(jìn)行擴(kuò)增得到多態(tài)性條帶大小為:lane7，172bp、187bp、320bp和450bp，電泳結(jié)果參見(jiàn)圖1。
[0118]實(shí)施例2
[0119]本實(shí)施例為了檢測(cè)構(gòu)建的多重PCR體系在分離后代中的結(jié)果，具體實(shí)施步驟如下:
[0120](1)提取番茄葉片DNA
[0121]待測(cè)材料$2(1227\0^27774-0)，對(duì)所有待測(cè)植株進(jìn)行單株取樣；
[0122](2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty_3和ty_5的引物，通過(guò)建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增；
[0123]PCR擴(kuò)增體系為:
[0124]lOng/yL模板DNA 2yL,
[0125]4pmmol/L 的引物對(duì) P6-25-F2/P6-25-R5 與 ty5_17R/F 各 0.5yL,
[0126]mix酶10yL，
[ΟΙ27]雙蒸水或三蒸水加至20yL;
[0128]PCR反應(yīng)體系中所用引物為:
[0129]T0302R:AGTGTACATCCTTGCCATTGACT
[0130]T0302F:TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC；
[0131]ty5-17R:TAACAAAGCCCTCAAAGC
[0132]ty5-17F:GTCTCCGAAACGTAATCC；
[0133]多重PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min;每個(gè)循環(huán)95°C變性45sec，51°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin;
[0134](3)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè);包括
[0135]a)制備聚丙烯酰胺凝膠，步驟如下:
[0136]玻璃板處理:KOH溶液浸泡玻璃板一定時(shí)間，用去污劑和清水清洗干凈，最后用雙蒸水沖洗兩遍；自然晾干;用95 %乙醇擦拭長(zhǎng)短板；
[0137]固定玻璃板:長(zhǎng)板處理面向上，短板處理面向下蓋到長(zhǎng)板上，用橡膠條固定兩個(gè)板，插入垂直電泳儀支架，短板向里固定，即凹口板面向電泳液方向，用1 %的瓊脂糖密封橡膠條與玻璃板之間的縫隙；
[0138]配制8 %丙烯酰胺膠溶液:30 %丙烯酰胺溶液:5.3mL ; 10 X TBE: 2mL ;雙蒸水:12.7mL； TEMED:20yL； 10%APS:200yL；
[0139]灌膠:將電泳槽傾斜30度，緩緩地使膠溶液倒入兩板間，等膠溶液快要溢出時(shí)，把玻璃板放平，用薄塑料板趕氣泡，倒插梳子；
[0140]凝固:灌完膠后，放于室溫讓其自然凝固，觀察膠邊沿出現(xiàn)折射線就表明膠已凝固；凝膠可立即使用，或保存于室溫24小時(shí)，4°C48小時(shí)；
[0141]b)聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟如下:
[0142]倒液:向電泳儀下端槽內(nèi)倒1 X TBE約500mL，向上槽倒1 X TBE，使液面高于短板上沿。拔出梳子，并用注射器吸取適量電泳液把點(diǎn)樣孔洗干凈(因?yàn)槭嶙尤〕龊螅嶙由衔降募澳z頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則)；
[0143]上樣:取1.6yLPCR產(chǎn)物上樣;調(diào)節(jié)電壓160V，電泳2.0，電泳完畢，關(guān)掉電泳儀，取下玻璃板；
[0144]c)聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色，步驟如下:
[0145]固定:固定液由0.5 %乙酸2.5mL、雙蒸水450mL、10 %乙醇50mL組成;把經(jīng)冷卻的膠板置于盛上述有固定液的1.5L的塑料盤(pán)中，搖床震蕩6min左右；
[0146]染色:染色液由硝酸銀lg、雙蒸水500mL組成;把清洗干凈的膠板置于盛有染色液的塑料盤(pán)中，搖床震蕩12min左右；
[0147]洗膠:把經(jīng)染色的膠板置于盛有500mL雙蒸水的塑料盤(pán)中清洗30s;倒掉清洗液，加入500mL雙蒸水，雙蒸水中加入120yL 10%的Na2S203，清洗30s。
[0148]顯色:顯色液由7.5gNa0H、37 % -40 %甲醛1.5mL、雙蒸水500mL組成；把清洗干凈的膠板置于盛有顯色液的塑料盤(pán)中顯色。顯色時(shí)間根據(jù)條帶和背景顏色深淺調(diào)整，達(dá)到DNA條帶清晰的目的(一般5_6min);顯色液用前可以先預(yù)冷至4-10°C，防止背景加深；
[0149]終止顯色:把染色完畢的膠板放回盛有固定液的塑料盤(pán)中，反應(yīng)3min。用雙蒸水清洗兩次，每次2min;
[0150]干膠:膠板用保鮮膜密封，置于室溫自然干燥;條帶統(tǒng)計(jì)、拍照留存；
[0151](4)對(duì)照電泳結(jié)果進(jìn)行結(jié)果分析；
[0152]電泳結(jié)果如圖2所示，1、2、8、14分別代表單株中含有純合的ty-5，雜合的Ty-3;3代表單株中含有雜合17-3，不含有七7-5;4、7、11、13、16、20代表單株中含有純合17-3，不含有ty-5; 5代表單株中含有純合Ty-3合ty-5; 6、12、19代表單株中Ty-3和ty-5均為雜合基因型；
9、10、18代表單株中含有雜合ty-5，不含有Ty-3 ; 15、17代表單株中含有純合ty-5，不含有Ty-3 ο
[0153]上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來(lái)限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，其包括以下步驟: 1)從番茄葉中提取待檢測(cè)番茄葉片DNA; 2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty-3和ty-5的引物，通過(guò)建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增； 3)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)； 4)對(duì)待測(cè)番茄樣品中是否含有Ty-3基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟1)中的番茄葉取自育種、野生、分離群體番茄品種的番茄葉。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2)中，Ty-3引物為: P6-25-F2:GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC P6-25-R5:GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC； ty-5引物為: ty5-17R:TAACAAAGCCCTCAAAGC ty5-17F:GTCTCCGAAACGTAATCC。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟2)中，多重PCR反應(yīng)體系為: lOng/yL模板DNA 2yL， 4pmmol/L 的引物對(duì)P6-25-F2/P6-25-R5 與 ty5-17R/F各0.5yL， 1^叉酶1(^1^， 雙蒸水或三蒸水加至20yL ； 多重PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min ；每個(gè)循環(huán)95°C變性45sec，51°C退火45sec，72°C延伸45sec，共38個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)電泳采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，電泳的具體步驟包括: a)制備聚丙烯酰胺凝膠:KOH溶液浸泡玻璃板一定時(shí)間，用去污劑和清水清洗干凈，最后用雙蒸水沖洗，晾干后用乙醇擦拭長(zhǎng)短板;然后將長(zhǎng)板處理面向上，短板處理面向下蓋到長(zhǎng)板上，用橡膠條固定兩個(gè)板，插入垂直電泳儀支架，短板向里固定，即凹口板面向電泳液方向，用1 %的瓊脂糖密封橡膠條與玻璃板之間的縫隙；在30 %的丙烯酰胺溶液加入10 XTBE、雙蒸水、TEMED以及10 %的APS配置成8 %的聚丙烯酰胺溶液;然后將電泳槽傾斜30度，緩緩地使聚丙烯酰胺溶液倒入兩板間，等膠溶液快要溢出時(shí)，把玻璃板放平，用薄塑料板趕氣泡，倒插梳子;灌完膠后，放于室溫讓其自然凝固，觀察膠邊沿出現(xiàn)折射線就表明膠已凝固； b)聚丙烯酰胺凝膠電泳:向電泳儀下端槽內(nèi)倒1X TB，向上槽倒1 X TBE，使液面高于短板上沿，拔出梳子，并用注射器吸取適量電泳液把點(diǎn)樣孔洗干凈;取PCR產(chǎn)物上樣;調(diào)節(jié)電壓160V，電泳1.5-2.0h，電泳完畢； c)聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色:把經(jīng)冷卻的膠板置于盛有固定液的塑料盤(pán)中，搖床震蕩3-8min;然后將膠板置于盛有染色液的塑料盤(pán)中，搖床震蕩10-15min;經(jīng)染色的膠板用雙蒸水清洗，然后用添加了濃度為10%的Na2S203的雙蒸水清洗;將清洗干凈的膠板置于顯色液中顯色，至DNA條帶清晰后將顯色完畢的膠板放回固定液中反應(yīng)，反應(yīng)完成后用雙蒸水清洗，然后用保鮮膜密封，置于室溫自然干燥，條帶統(tǒng)計(jì)、拍照留存。6.根據(jù)權(quán)利要求5多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述固定液由0.5%乙酸2.5mL、10 %乙醇50mL、雙蒸水450mL組成;所述染色液由硝酸銀與雙蒸水組成，其中硝酸銀與雙蒸水的質(zhì)量比為1:500。7.根據(jù)權(quán)利要求5多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述顯色液由7.5g NaOH、37 %-40 %的甲醛1.5mL、雙蒸水500mL組成。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟4)對(duì)待測(cè)樣品中Ty-3基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定方法具體步驟為:在步驟3)酶切后的多態(tài)性條帶中大找出450bp和172bp條帶，即分別對(duì)應(yīng)Ty-3基因和ty-5基因。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種番茄Ty-3基因和ty-5基因的多重PCR檢測(cè)方法，其包括：1)從番茄葉中提取待檢測(cè)番茄葉片DNA；2)以上述番茄葉片提取獲得的DNA為模板，利用Ty-3和ty-5的引物，通過(guò)建立的多重PCR反應(yīng)體系，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；3)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)；4)對(duì)待測(cè)番茄樣品中是否含有Ty-3基因和ty-5基因進(jìn)行鑒定等步驟。本發(fā)明用于快速鑒定番茄材料中是否含有番茄黃化曲葉病抗性基因Ty-3和ty-5，有利于對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行聚合育種時(shí)，對(duì)抗病基因材料的篩選。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105463079
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510916629
【發(fā)明人】王銀磊, 趙統(tǒng)敏, 余文貴, 趙麗萍, 楊瑪麗, 姜靜, 李亞茹
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2015年12月10日