一種與致病力相關(guān)的灰霉病菌基因BcFch1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物保護(hù)領(lǐng)域中控制真菌致病性的 基因及其編碼蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又稱作灰葡萄孢，屬于子囊菌門（Ascomycota) 真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多種植物，包括幾乎所有的蔬菜及果樹(shù)。寄主從苗期、 掛果期到貯存期均可發(fā)病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，葉部發(fā)病的典型癥狀表 現(xiàn)為"V"形病斑，花部主要表現(xiàn)為腐爛和調(diào)萎，果實(shí)主要表現(xiàn)為腐爛和脫落。病害的發(fā)生和 蔓延與環(huán)境的濕度、溫度存在密切的關(guān)系，在20°C_23°C，相對(duì)濕度90%以上時(shí)發(fā)生嚴(yán)重。因 此，灰霉病屬低溫高濕型病害，在多雨季節(jié)或者保護(hù)地生產(chǎn)中極易發(fā)生，世界上每年因該病 導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)100-1000億美元。由于寄主范圍廣泛，生產(chǎn)上危害嚴(yán)重，再加上相關(guān)分 子研究技術(shù)成熟，灰霉病菌已成為最重要的模式植物病原真菌之一，受到廣泛研究。
[0003] 灰霉病菌是典型的死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌，可生成多種致病因子參與致病，主要包 括細(xì)胞壁降解酶類、角質(zhì)酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反應(yīng)的酶類、小RNA及小分子物質(zhì)等， 這些因子相互協(xié)作使灰霉病菌能夠殺死寄主細(xì)胞，并分解死亡的寄主組織作為營(yíng)養(yǎng)。自然 條件下，灰霉菌多以分生孢子作為侵染寄主的初侵染和再侵染來(lái)源?；颐共【Ｒ跃z體、 分生孢子或菌核附著在植物病殘?bào)w上，或在土壤中越冬和越夏，成為下一生長(zhǎng)季的初侵染 來(lái)源。當(dāng)條件適宜時(shí)，菌核萌發(fā)產(chǎn)生菌絲體和分生孢子梗，并產(chǎn)生大量的分生孢子。成熟的 分生孢子能夠借助風(fēng)、雨水、灌概水和農(nóng)事操作等進(jìn)行傳播。在低溫高濕條件下，分生孢子 萌發(fā)形成芽管，芽管末端稍稍膨大發(fā)育成附著胞或者進(jìn)一步形成侵染墊等侵染結(jié)構(gòu)，主要 從衰敗的花器、傷口以及壞死組織侵入。
[0004] 當(dāng)高濃度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主時(shí)，發(fā)病迅速，此時(shí)主要通過(guò)芽管頂端形 成的附著胞侵入;伴隨孢子濃度降低，通過(guò)芽管頂端侵入的比例降低，發(fā)病速度也相應(yīng)延緩 1-4天，此時(shí)主要通過(guò)由菌絲發(fā)育成的附著胞或侵染墊侵入?；颐共【秩爰闹骷?xì)胞后，將 會(huì)直接面臨寄主組織內(nèi)敵對(duì)環(huán)境的挑戰(zhàn)，病原菌必須迅速做出調(diào)整，一方面抑制植物的防 御反應(yīng)，另一方面要積極適應(yīng)寄主細(xì)胞內(nèi)物理、化學(xué)環(huán)境，做到這兩方面，灰霉病菌才有望 成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通過(guò)改變自身的代謝途徑，并分泌相關(guān)效應(yīng)因 子(如毒素)來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的，但參與相應(yīng)過(guò)程的基因、蛋白及代謝產(chǎn)物及其調(diào)控的分子 機(jī)制仍所知甚少。對(duì)該領(lǐng)域進(jìn)行深入研究，鑒定灰霉病菌用以適應(yīng)寄主內(nèi)環(huán)境的關(guān)鍵因子， 不僅有助于揭示灰霉病菌這種死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌致病的分子機(jī)制，還有可能從中發(fā)現(xiàn)可 以作為殺真菌劑作用靶標(biāo)的蛋白質(zhì)，為開(kāi)發(fā)防治灰霉病及其它類似病害的高效藥劑奠定理 論和技術(shù)基礎(chǔ)。
[0005] Fchl是一種亞鐵螯合酶，參與催化血紅素合成途徑的最后一步反應(yīng)(第八步）。該 蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等生物，由于血紅素可以作為眾多蛋白的輔基參與 多種生命過(guò)程，因此，作為催化血紅素合成酶類之一的Fchl蛋白質(zhì)具有重要的功能。Fchl蛋 白質(zhì)在灰霉病菌中同樣存在，而且功能尚未獲得鑒定，通過(guò)分析灰霉病菌Fchl編碼基因的 致病功能，評(píng)價(jià)該基因在灰霉病菌發(fā)育及致病過(guò)程的作用，有利于鑒定潛在的防治靶標(biāo)，用 于篩選新型殺真菌藥劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的旨在提供一種控制致病性的基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明所提供的控制致病性基因來(lái)源于灰霉病菌，名稱為BcFchl，其DNA序列如 SEQ ID No:l所示。該DNA序列為BcFchl基因開(kāi)放閱讀框，由1409個(gè)核苷酸組成，其中包含3 個(gè)外顯子，分別位于SEQ ID No: 1的5'端第1位至267位核苷酸之間、第321位至903位核苷酸 之間和第952位至1409位核苷酸之間，組成的編碼區(qū)長(zhǎng)度合計(jì)為1308個(gè)核苷酸。
[0008] 本發(fā)明提供了BcFchl基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，該 序列由435個(gè)氨基酸組成。
[0009] 來(lái)自灰霉病菌的控制致病性基因 BcFchl可應(yīng)用于植物抗灰霉病基因工程領(lǐng)域。
[0010] 對(duì)來(lái)自灰霉病菌的控制致病性基因 BcFchl所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行缺失、突變或修 飾，而使其致病力發(fā)生缺陷，可作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明證明了BcFchl基因的缺失或突變，導(dǎo)致灰霉病菌致病力顯著降低，說(shuō)明 BcFchl基因是灰霉病菌引起農(nóng)作物灰霉病所必需的基因。因此，篩選能夠阻止該基因表達(dá) 與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的發(fā)生，從而有助于開(kāi)發(fā)新 型殺菌劑，即本發(fā)明所提供的BcFchl基因的一個(gè)重要用途是:該基因的表達(dá)與其編碼的蛋 白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)、修飾及定位，可以作為重要候選靶標(biāo)位點(diǎn)，用于抗真菌藥劑(特別是抗灰 霉病菌藥劑)的設(shè)計(jì)和篩選。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為BcFchl蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析示意圖
[0013] 其中：Ferrochelatase為亞鐵螯合酶結(jié)構(gòu)域；
[0014] 圖2為灰霉病菌BcFchl基因的敲除策略(通過(guò)同源重組進(jìn)行基因替換)示意圖 [0015] 其中：WT為野生型菌株B05.10，pFchl-ko為敲除載體，BcFchl-KO為BcFchl基因缺 失突變體，a、b、c、d為用于驗(yàn)證突變體及互補(bǔ)菌株的引物；
[0016]圖3為BcFchl基因缺失突變體及遺傳互補(bǔ)菌株的PCR驗(yàn)證電泳圖
[0017] 其中：a、b、c、d為所用引物，相應(yīng)位置見(jiàn)圖2;M1為BcFchl基因缺失突變體;Ml/Fchl 為在突變體Ml基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入完整BcFchl基因的互補(bǔ)菌株；
[0018] 圖4為BcFch 1基因的突變體與野生型菌株的致病力比較照片
[0019] 其中：所選擇寄主為番茄，采用離體葉片接種菌餅的方法，接種3天后進(jìn)行評(píng)價(jià)； Ml、M2為兩株獨(dú)立獲得的BcFchl基因缺失突變體；
[0020] 圖5為BcFchl基因的突變體與對(duì)照菌株侵染寄主所產(chǎn)生病斑大小的定量分析示意 圖
[0021] 其中：接種方法同上，接種3天后對(duì)葉片病斑面積進(jìn)行測(cè)量計(jì)算，換算成相對(duì)大 小。**表示在ρ〈0·01水平上差異顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了更好地描述本發(fā)明，下面通過(guò)具體的實(shí)施例予以進(jìn)一步的說(shuō)明，下述實(shí)施例 中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0023]實(shí)施例lBcFchl基因的相關(guān)性分析
[0024] 灰霉病菌BcFchl基因的開(kāi)放閱讀框由1409個(gè)核苷酸組成，包含3個(gè)外顯子，編碼區(qū) cDNA全長(zhǎng)為1308個(gè)核苷酸，編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物由435個(gè)氨基酸組成。取BcFchl蛋白質(zhì)序列進(jìn) 行比對(duì)分析(http://blast .ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)，發(fā)現(xiàn)Fchl廣泛存在于動(dòng)物、植 物、真菌和細(xì)菌等細(xì)胞生物中。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，BcFchl蛋白質(zhì)包含一個(gè)保守的亞鐵螯合酶 結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖1)。
[0025] 實(shí)施例2BcFchl基因的敲除
[0026] 1)敲除載體的構(gòu)建
[0027] 采用引物FcM-UP-FG ' -CTCGAGAAGAGCGGCAAGCGTGGGA-3 '）與FcM-UP-lU 5 ' -GGTACCGGTACTCGAAAGGCAGACAGA-3'），以灰霉病菌菌株B05.10的基因組DNA為模板擴(kuò)增 BcFchl 基因上游 794bp 片段，采用 Fchl-DN-F(5'-GGATCCGATGTCCTGGATGCAAGAGTGA-3'）與 Fchl-DN-R(5'-CTGCAGGTGGGTTGGTGTACGATATTCG-3'）擴(kuò)增灰霉病菌 BcFchl 基因下游 767bp 片