段，反應體系為：1 Ommo 1 /L dNTP Mixture，0 · 5yL; 10 X PCRbuf f er，2 · 5yL;上下游引物各 1 yL (1 Ομπιο 1 /mL);模板DNA，lyL; Ex-Taq，0 · 2yL (5U); ddH20，18 · 8yL;擴增程序為：94°C預變性 3分鐘，然后（1)94°C，變性50秒；（2) 58°C，退火50秒；（3) 72°C，延伸60秒；（4)循環(huán)30次；（5) 72°C延伸10分鐘。將上述兩段DNA擴增產物先后克隆至pXEH載體的Xho I、Kpn I位點之間與 BamH I、Pst I位點之間，構建成敲除載體pFchl-ko(見圖2)，并進行測序驗證。
[0028] 2)灰霉病菌的轉化
[0029] a.農桿菌的培養(yǎng)
[0030]挑取含有雙元載體pFchl-ko的根癌農桿菌菌株Agl-Ι單菌落，接種至含50μg/ml卡 那霉素、1(^/1111利福平的11液體培養(yǎng)基(磷酸氫二鉀0.205%，磷酸二氫鉀0.145%，氯化鈉 0.015 %，七水硫酸鎂0.05 %，六水氯化鈣0.01 %，七水硫酸亞鐵0.00025 %，硫酸銨0.05 %， 葡萄糖0.2 % )中，250rpm、28°C振蕩培養(yǎng)48h; 4000rpm，離心5分鐘，棄上清，頂液體培養(yǎng)基 (磷酸氫二鉀0.205%，磷酸二氫鉀0.145%，氯化鈉0.015%，七水硫酸鎂0.05%，六水氯化 鈣0 · 01 %，七水硫酸亞鐵0 · 00025%，硫酸銨0 · 05%，葡萄糖0 · 2%，200yMAS，MES 0 · 854%， 甘油0.5 % )重懸，4000rpm離心5分鐘，棄上清；頂培養(yǎng)基重懸，28°C，250rpm振蕩培養(yǎng)6h，進 行預誘導。
[0031] b.灰霉病菌的產孢培養(yǎng)
[0032]選用B05.10菌株，取少量孢子涂布于PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯20 %煮爛過濾，葡萄糖 2 %，瓊脂1.5 % )，置28°C培養(yǎng)8h令孢子快速萌發(fā)，然后轉移至20°C培養(yǎng)3-5天，待菌體表面 被灰色孢子覆蓋之后，用IM液體培養(yǎng)基刮取、收集孢子，顯微鏡觀察，利用血球計數器調節(jié) 孢子濃度為lX10 6/mL。
[0033] c.根癌農桿菌與灰霉病菌分生孢子共培養(yǎng)及轉化子篩選
[0034] 將在IM液體培養(yǎng)基中預先誘導6h的農桿菌菌液和灰霉病菌孢子液等體積混合，加 入AS，使終濃度達到500μΜ，混勻，然后按250~350μ!7皿，均勻涂抹至鋪有玻璃紙的IM培養(yǎng) 基上，22°C黑暗培養(yǎng)48h;共培養(yǎng)完畢后，將玻璃紙轉移至含有100yg/mL潮霉素的PDA培養(yǎng)基 上，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。4~7天后挑取擴展的菌落到含有同樣抗生素的篩選培養(yǎng)基上。 [0035] 3)缺失突變體的驗證
[0036]選用兩對引物通過PCR擴增對轉化子進行篩選。擴增結果符合如下結果的，確定為 BcFchl基因缺失突變體:上游同源臂之外基因組上的引物 Β ' ） 與潮霉素抗性基因 的引物b (5 ' -ACAGACGTCGCGGTGAGTTCA-3 ' ）配對可以擴增到預期大小 (1 · 5kb)的重組片段；而編碼區(qū)引物c (5 ' -GGGGATTTCTTGAGTAGATTATTTG-3 '）與d(5 ' -CATCACGGCGTAGACTGTAGC-3 '）無擴增條帶(野生型菌株可擴增到0.8kb片段）。結果，從轉化 子中篩選到2株BcFchl基因缺失突變體:Ml與M2菌株，用于后續(xù)功能分析(見圖3)。
[0037] 實施例3BcFchl基因缺失突變體的遺傳互補
[0038]采用引物C-F( 5 ' -GAATTCTTGTTCGCTTCCTCTTCGTC-3 '）與C-R( 5 ' -CTGCAGGTGGGTTGGTGTACGATATTCG-3 '），擴增灰霉病菌BcFch 1 基因全長3116bp (包含啟動子、 開放閱讀框與終止子），先克隆至pMD18-t載體上，然后再亞克隆至pSULF載體(含有氯嘧磺 隆抗性基因）的EcoRI與Pst I位點之間，構建成遺傳互補載體pFchl-ko-c。載體經測序驗 證，確認沒有氨基酸突變。采用如前所述的農桿菌介導的轉化方法，使用1 〇〇yg/mL氯啼磺隆 進行篩選，將該互補片段轉入BcFchl基因缺失突變體Ml基因組中，獲得遺傳互補菌株Ml/ Fchl。選用突變體驗證時曾使用的引物a與b、c與d進行PCR擴增，結果符合預期（見圖3):與 突變體Ml相同，互補菌株Ml/Fchl中原有的BcFchl基因被替換為潮霉素抗性基因 HPH(引物a 與b擴增結果為陽性），但額外擁有一個后續(xù)轉入的BcFchl基因（編碼區(qū)引物c與d擴增結果 同樣為陽性）。
[0039]實施例4BcFchl基因在灰霉病菌致病性方面的作用
[0040]采用離體葉片接種法，評價BcFchl突變體的致病力變化情況。從溫室培養(yǎng)的番茄 植株上采集成熟葉片，水平放置容器中，使用打孔器打取待測菌株菌餅，正面朝下反扣至葉 片上，20°C保濕黑暗培養(yǎng)，3天后評價待測菌株的致病力。實驗結果顯示，BcFchl突變體基本 喪失了致病能力，只能在接種點附近發(fā)現(xiàn)微小病斑，且不擴展。與此形成鮮明對照的是，野 生型可成功侵染番茄葉片，并迅速蔓延至大半個葉面(見圖4)。遺傳互補菌株Ml/Fchl的致 病力正常，可恢復到野生型水平。對葉片病斑面積進行測量計算，發(fā)現(xiàn)BcFchl突變體侵染引 起的病斑面積不足野生型引起的20% (見圖5)。將上述發(fā)病葉片表面進行消毒，研磨后涂布 至TOA平板上，培養(yǎng)2天后計數灰霉病菌菌落個數。研究發(fā)現(xiàn)，BcFchl突變體侵染的葉片在接 種三天后幾乎沒有活的菌體，而野生型侵染的葉片研磨后可以獲得近百個菌落。該研究結 果表明，BcFchl是一個關鍵的致病基因，是灰霉病菌侵染寄主所必需的，如果該基因或其編 碼的蛋白質喪失活性，灰霉病菌將失去侵染寄主引發(fā)病害的能力。
[0041 ] 序列表
[0042]
[0043] SEQ ID No :2的序列
[0044] (i)序列特征：（A)長度:435個氨基酸；（B)類型:氨基酸；（C)鏈性:單鏈。
[0045] (ii)分子類型：多肽
[0046] (iii)序列描述:SEQ ID No:2 「71
【主權項】
1. 一種來自灰霉病菌(Botrytis cinerea)的控制致病性基因BcFchl，其特征在于其 DNA序列如SEQ ID No:l所示。2.-種根據權利要求1所述的來自灰霉病菌的控制致病性基因BcFchl所編碼的蛋白 質，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N〇:2所示。3.權利要求1所述來自灰霉病菌的控制致病性基因BcFchl在植物抗灰霉病基因工程領 域中的應用。4.對權利要求2所述來自灰霉病菌的控制致病性基因BcFchl所編碼的蛋白質進行缺 失、突變或修飾，使其致病力發(fā)生缺陷，作為靶標在設計和篩選抗真菌藥劑中的應用。
【專利摘要】一種與致病力相關的灰霉病菌基因BcFch1及其應用屬微生物基因工程技術領域，本發(fā)明提供的來自灰霉病菌的控制致病性的基因BcFch1，其DNA序列如SEQ？ID？No:1所示，由1409個核苷酸組成；提供的BcFch1基因所編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ？ID？No:2所示，由435個氨基酸組成；BcFch1基因可在植物抗灰霉病基因工程領域中應用；通過對灰霉病菌控制致病性的蛋白質BcFch1進行缺失、突變或修飾，而使其致病力發(fā)生缺陷，可作為靶標在設計和篩選抗真菌藥劑中應用。FGSC 1031720011012
【IPC分類】C12N15/60, C12N9/88
【公開號】CN105483106
【申請?zhí)枴緾N201610044625
【發(fā)明人】李桂華, 李樂濤, 秦慶明, 張明哲
【申請人】吉林大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月22日