TGFβ2基因、TGFβ2多肽及它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地講，本發(fā)明涉及TGF02基因、TGF02多肽及它們的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性中發(fā)病率最高、危害最嚴重的惡性腫瘤之一。近年來，隨著治療手段 的更新、治療方案的改進及治療方式的多樣化，乳腺癌的臨床治療效果得到了很大改善，但 是全世界目前每年仍有約50萬人死于乳腺癌。究其原因，乳腺癌是一類分子水平上具有高 度異質(zhì)性的疾病。在臨床、病理組織學(xué)形態(tài)上相同的腫瘤，其分子遺傳學(xué)改變并不一定相 似，這些因素影響了其治療及預(yù)后，因此以分子分型差異為依據(jù)，進行個體化治療是未來乳 腺癌治療的發(fā)展方向。
[0003] 腫瘤分子分型最早是在1999年由美國國立癌癥研究所提出，通過綜合的分子分析 技術(shù)使腫瘤的分類基礎(chǔ)由形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)向以分子特征為基礎(chǔ)的新的腫瘤分類系統(tǒng)。乳腺癌根據(jù) 其不同的分子特征化1?、？1?、冊1?2、燈67等狀態(tài)），一般可分為1^1^11 &1八型化1?、？即日性，冊1?2 陰性、Ki67低表達）、Luminal B型(ER、PR陽性，HER2陰性或陽性、Ki67高表達或任何水平）、 HER2過表達型(ER、PR陰性，HER2陽性）、基底樣型，其中基底樣型乳腺癌約80%均不表達ER、 PR及HER2，也稱為"三陰性"乳腺癌（TNBC)。
[0004] 不同的分子分型其治療方案及愈后也不盡相同。Luminal A型多以內(nèi)分泌治療為 主?；贚uminal B型的上述特殊性，患者在內(nèi)分泌治療的基礎(chǔ)上，有時須接受化療和抗 HER2靶向治療。HER2過表達的乳腺癌亞型以靶向治療和化療為主。而三陰性乳腺癌（TNBC) 因其缺乏內(nèi)分泌和靶向治療的靶點，其對內(nèi)分泌療法和HER2靶向療法均無效，臨床治療上 主要依靠化療，預(yù)后極差，5年生存率不到15%。
[0005] 流行病學(xué)資料顯示，TNBC好發(fā)于年輕女性(年齡〈50歲），其發(fā)病較為隱匿，通過乳 腺鉬靶首次檢出乳腺癌的幾率低。與其他亞型的乳腺癌相比，TNBC的遠處復(fù)發(fā)至死亡的中 位間期明顯縮短(平均9個月），因此迫切需要尋找TNBC特異性的檢測標(biāo)記物和治療靶點。
[0006] TGF0是一類功能十分復(fù)雜的多肽類細胞因子超家族，家族包括TGFm-i35,其中TGF β?在生理情況下活性最強，但在病理及應(yīng)激情況下，TGF02可能起著重要作用。TGF0不僅是 一個經(jīng)典的免疫抑制因子，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用，在腫瘤發(fā)生的早期 TGF0發(fā)揮著抑制腫瘤生長的作用，但在晚期又可促進腫瘤的發(fā)生。另外TGF0在維持腫瘤干 細胞的特性中也發(fā)揮著重要作用，最近多個研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞通過自分泌或者旁分泌TGF0 維持腫瘤干細胞的特性。
[0007] 此外，關(guān)于TGF02作為乳腺癌血清學(xué)檢測標(biāo)志物未見有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為填充現(xiàn)有技術(shù)的空白，本發(fā)明的目的是提供TGF02基因、TGF02多肽及它們的應(yīng) 用，尤其是它們作為檢測三陰性乳腺癌血清標(biāo)志物的應(yīng)用，為乳腺癌的檢測尤其是"三陰 性"乳腺癌檢測提供新的靶點，并且為抗腫瘤藥物的設(shè)計和篩選提供了新的資料。
[0009] 具體的講，首先，我們利用RT-PCR方法在不同分子分型乳腺癌細胞系中檢測TGF02 表達，發(fā)現(xiàn)TGF02在三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T中表達含量明顯高于 Luminal A型MCF7、T47D細胞系，和Luminal B型BT474細胞系，以及HER2過表達型SKBR3細胞 系。
[0010] 此外，我們利用酶聯(lián)免疫實驗檢測以上不同分子分型乳腺癌細胞系培養(yǎng)上清中的 TGF02蛋白含量，發(fā)現(xiàn)TGF02在三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T的培養(yǎng)上清 中的含量明顯高于其他分子分型乳腺癌細胞系。
[0011] 進一步，我們通過免疫組織化學(xué)對不同分子分型的臨床乳腺癌標(biāo)本檢測TGF02表 達，發(fā)現(xiàn)TGF02在病理確定為三陰性乳腺癌的標(biāo)本中表達量高于其他分子分型乳腺癌。 [0012]另外，我通過利用酶聯(lián)免疫實驗對乳腺癌患者血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)TGF02在三陰 性乳腺癌的血清標(biāo)本中表達量同時也高于其他分子分型乳腺癌患者。
[0013] 因此本發(fā)明涉及TGF02基因、TGF02多肽及它們的應(yīng)用，尤其是它們作為檢測三陰 性乳腺癌新的標(biāo)志物的應(yīng)用。
[0014] 所述的TGF02基因的序列如SEQ ID N0:1所示；
[0015] 由上述TGFI32基因編碼形成的TGFI32多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0016] 它們（TGF02基因和TGF02多肽)作為作為檢測三陰性乳腺癌新的血清學(xué)標(biāo)志物的 應(yīng)用。
[0017 ] 其中三陰性乳腺癌為ER、PR及HER2，所述的ER、PR及HER2均為陰性。
[0018]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0019]以TGF02基因為例，TGF02基因不僅在三陰性乳腺癌細胞系中表達升高，也在三陰 性乳腺癌組織標(biāo)本和血清中表達較其他分子分型乳腺癌升高。該基因定位于人染色體 lq41，序列全才5966bp，開放讀碼框1328bp，編碼442個氨基酸。本發(fā)明的TGFI32基因不僅可 作為目前臨床乳腺癌分子分型中三陰性乳腺癌分型的新檢測靶點，而且可通過對乳腺癌患 者血清中TGF02進行檢測，快速的進行乳腺癌分子分型，優(yōu)于目前乳腺癌分子分型基于癌組 織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)檢測方法。以這一基因為靶點，在基因水平上和蛋白水平上設(shè)計新 的化學(xué)實體，可快速、便捷、有效的進行乳腺癌的分子分型，從而提高乳腺癌治療的療效。
【附圖說明】
[0020] 圖1為TGF02轉(zhuǎn)錄本在不同分子分型的乳腺癌細胞系中的表達結(jié)果圖：在三陰性乳 腺癌細胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T中TGF02在mRNA水平上表達明顯高于Luminal A型 MCF7、T47D細胞系，和Luminal B型BT474細胞系，以及HER2過表達型SKBR3細胞系（圖中縱坐 標(biāo)TGF02relative mean expression 中文含義為TGF02的相關(guān)表達）。
[0021] 圖2為TGF02蛋白（多肽)在不同分子分型的乳腺癌細胞系培養(yǎng)上清中的表達結(jié)果 圖：在蛋白水平上TGF02在三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T中含量明顯高于 Luminal A型MCF7、T47D細胞系，和Luminal B型BT474細胞系，以及HER2過表達型SKBR3細 胞系（圖中縱坐標(biāo)TGFf32in culture media的中文含義為TGFI32培養(yǎng)上清中的含量）。
[0022]圖3A為TGF02在不同分子分型的乳腺癌標(biāo)本中表達結(jié)果圖：
[0023] 圖3A:TGFf32的免疫組織化學(xué)圖，顯示TGFI32在三陰性乳腺癌組織標(biāo)本中表達量高 于Luminal A型、Luminal B和HER2過表達型。
[0024]圖4為TGF02在不同分子分型的乳腺癌患者血清中的表達結(jié)果圖：顯示TGF02在三 陰性乳腺癌患者血清中的表達量明顯高于正常人、和乳腺癌Luminal A型、Luminal B和 HER2過表達型患者（圖中縱坐標(biāo)TGF02in serum of breast canser patients的中文含義 為TGF02在乳腺癌患者血清中的含量）。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步的描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限 于此：
[0026] 實施例1:細胞培養(yǎng)
[0027] 人乳腺癌細胞系MCF7、T47D(Luminal A型），BT474(Luminal B型），
[0028] SKBR3(HER2 過表達型），MDA-MB-231、BT549、Hs578T(TNBC)為廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研 究所保存。細胞均用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)，置于37°C，5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 [0029]實施例2:實時定量PCR分析TGF02在乳腺癌各細胞系中的表達
[0030] 取生長至對數(shù)期的各種培養(yǎng)細胞，TRIZ0L方法提取總RNAdNasel消化后，測量 RNA.以oligdT為引物取等量的RNA按照Fermentas公司Reverse Transcription System程 序逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBGreen操作說明，用以下引物進行實時定量PCR擴 增，TGFI32基因編碼區(qū)引物：
[0031] SEQ ID NO:3 Forward：5'-TAGACATGCCGCCCTTCTTC-3'
[0032] SEQ ID N0:4 Reverse:5，-CAAGGTACCCACAGAGCACC-3'
[0033]擴增片段為114bp
[0034] GAPDH基因編碼區(qū)引物：
[0035] SEQ ID NO :5 Forward：5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3'
[0036] SEQ ID N0:6 Reverse:5，-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3'
[0037