] 擴(kuò)增片段為156bp
[0038] PCR反應(yīng)參數(shù)：95°C 5min;95°C 30sec，59°C 30sec，72°C 30min共40個(gè)循環(huán)。70°C 至95°C繪制溶解曲線。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以GAPDH為內(nèi)對照，通過2- Δ Δ CT法計(jì)算各組之 間目標(biāo)基因 TGF02表達(dá)水平的差異;按照下列公式計(jì)算樣本的相對表達(dá)量:其中Δ ACt= Δ Ct處理組一ACt對照組；ACt = CtTCRPl-Ct GAPDH;
[0039] 結(jié)論參見圖1所示：在三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T中TGF02在 mRNA水平上表達(dá)明顯高于Luminal A型MCF7、T47D細(xì)胞系，和Luminal B型BT474細(xì)胞系，以 及HER2過表達(dá)型SKBR3細(xì)胞系。
[0040] 實(shí)施例3:酶聯(lián)免疫法(ELISA)分析TGF02在乳腺癌各細(xì)胞系上清中的表達(dá)
[0041 ]準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)上清液:將目的細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液后并計(jì)數(shù)后，將1 X 106細(xì) 胞/孔接種于6孔板，培養(yǎng)終體積為2ml，培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，2000rpm/分鐘離心 后收集上清用于ELISA實(shí)驗(yàn)。
[0042] ELISA實(shí)驗(yàn)簡要步驟：
[0043] (1)使用前試劑盒內(nèi)所有試劑緩慢平衡至室溫，避免快速溶解造成蛋白降解。
[0044] (2)制備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液:將lml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入標(biāo)準(zhǔn)品中，室溫靜置10min，并反 復(fù)揉搓促進(jìn)溶解，此時(shí)濃度為160ng/ml，因標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度為40ng/ml，所以首先對標(biāo)準(zhǔn) 品液體進(jìn)行稀釋，之后再準(zhǔn)備7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋EP管，在每個(gè)EP管中加入500μ1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液， 進(jìn)行依次倍比稀釋。終濃度為40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2 · 5ng/ml、1 · 25ng/ml、 0·625ng/ml、0ng/ml〇
[0045] (3)制備檢測稀釋液A及B:在檢測稀釋液A及B中分別加入6ml去離子水稀釋，稀釋 后終體積為12ml。
[0046] (4)制備檢測溶液A及B:根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)計(jì)算所需總量(100μΙ/孔），利用檢測稀釋 液根據(jù)1:100比例進(jìn)行稀釋。
[0047] (5)制備洗滌液:按照1:30比例將濃洗滌液進(jìn)行稀釋。
[0048] (6)將細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本使用1 XPBS緩沖液稀釋10倍。
[0049] (7)加樣:設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測樣品孔(每個(gè)待測樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔），按照 設(shè)置孔的位置依次加入100μΙ倍比稀釋的不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品同樣設(shè)置3個(gè) 重復(fù)孔）、1XPBS緩沖液以及稀釋后的待測樣品。加樣后，酶標(biāo)板蓋上覆膜，37°C孵育2h。
[0050] (8)棄去液體，甩干，每孔加入檢測溶液A工作液100μΙ，酶標(biāo)板蓋上覆膜，37°C孵育 lh〇
[0051 ] (9)棄去液體，每孔加2 350μ1洗滌液，浸泡l-2min后甩掉酶標(biāo)板內(nèi)液體，盡量甩 干，避免碰觸孔底。共重復(fù)洗板3次。
[0052] (10)每孔加檢測溶液B工作液100μΙ，酶標(biāo)板蓋上覆膜，37°C孵育3h。
[0053] (11)重復(fù)步驟(9 )，共重復(fù)洗板5次。
[0054] (12)洗板后，甩凈孔內(nèi)液體，加底物溶液(90μ1 /孔），酶標(biāo)板蓋上覆膜，37°C避光顯 色(時(shí)間控制在15_25min)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)梯度藍(lán)色，最后3孔顯色不清時(shí)即可終止反應(yīng)。 [0055] (13)加終止溶液(50μ1/孔），此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色代表反應(yīng)終止。立即利用酶標(biāo)儀在 450nm波長測量每孔光密度（即0D值）。
[0056] (14)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光值及對應(yīng)濃度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式計(jì)算各 孔待測樣品濃度，乘以稀釋倍數(shù)后得出細(xì)胞培養(yǎng)上清液中目標(biāo)蛋白的濃度。
[0057] 結(jié)論參見圖2所示：TGF02在三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、BT549、Hs578T培養(yǎng) 上清中含量明顯高于Luminal A型MCF7、T47D細(xì)胞系，和Luminal B型BT474細(xì)胞系，以及 HER2過表達(dá)型SKBR3細(xì)胞系。
[0058] 實(shí)施例4:免疫組織化學(xué)檢測TGFI32在乳腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)
[0059] 取不同分子分型的乳腺癌癌組織標(biāo)本石蠟塊制作組織芯片，進(jìn)行切片，切片中TGF β2蛋白表達(dá)采用免疫組化法檢測，操作流程按組化試劑盒說明書(Abcam，USA)進(jìn)行。主要步 驟如下：
[0060] (1)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，PBS洗2~3次各5分鐘
[0061 ] (2)抗原熱修復(fù):水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至95°C左右，放入組 織芯片加熱10~15分鐘。
[0062] (3)每張切片加1滴或50yL 3%過氧化氫，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化 物酶的活性。PBS沖洗3次，每次間隔3min，除去PBS液。
[0063] (4)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
[0064] (5)每張切片加50yL的TGFI32單克隆抗體（CST，USA，1:100稀釋），在4°C下孵育過 夜。37°C復(fù)溫45分鐘，PBS沖洗3次，每次間隔3min。
[0065] (6)滴加羊抗兔Π 抗40~50μ1，室溫靜置1小時(shí);PBS洗3次各5分鐘；
[0066] (7)DAB顯色1~5分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
[0067] (7)PBS或自來水沖洗10分鐘；
[0068] (8)蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化；
[0069] (9)自來水沖洗10~15分鐘；
[0070] (10)脫水、透明、封片、鏡檢。
[0071] (11)結(jié)果判定:參照Pluot等的方法，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分 比進(jìn)行半定量處理:無染色(_)為〇分，染色弱(+ )為1分，染色強(qiáng)呈棕黃色(++)為2分，染色很 強(qiáng)深棕色（+++)為3分；陽性細(xì)胞數(shù)10%~50%者為2分，51 %~80%者為3分，>80%者為4 分。上述兩項(xiàng)評分相乘:不管其染色強(qiáng)度，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為(_)，3分為(+ )，4~5分為(+ + )，6~9分為(+++)。
[0072] 結(jié)果參見圖3A所示:TGF02在三陰性乳腺癌組織標(biāo)本中表達(dá)量高于Luminal A型、 Luminal B和HER2過表達(dá)型。
[0073] 實(shí)施例5:酶聯(lián)免疫法(ELI SA)檢測TGF02在乳腺癌患者血清中的表達(dá) [0074]準(zhǔn)備不同分子分型乳腺癌患者血清，取病理科已確診的乳腺癌患者促抗凝血5ml， 2000rpm/分鐘離心后收集血清。按照TGF02ELISA試劑盒操作說明，檢測乳腺癌患者血清中 的TGFKJLISA詳細(xì)步驟參見實(shí)施例3。
[0075] 結(jié)果參見圖4所示：TGF02在三陰性乳腺癌患者血清中的表達(dá)量明顯高于正常人、 和乳腺癌Luminal A型、Luminal B和HER2過表達(dá)型患者。
[0076]上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實(shí)施例的具體說明， 它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施例或變更 均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
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[0086]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種TGFβ2基因，其特征在于，所述的TGFβ2基因的序列如SEQIDN0:1所示。2. -種TGFβ2多肽，其特征在于，其由權(quán)利要求1所述的TGFβ2基因編碼形成的氨基 酸序列如SEQIDNO:2所示。3. 權(quán)利要求1所述的TGFβ2基因作為檢測三陰性乳腺癌血清標(biāo)志物的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的三陰性乳腺癌為ER、PR及HER2,所述的 ER、PR及HER2均為陰性。5. 權(quán)利要求2所述的TGFβ2多肽作為檢測三陰性乳腺癌血清標(biāo)志物的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的三陰性乳腺癌為ER、PR及HER2，所述的 ER、PR及HER2均為陰性。
【專利摘要】本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及TGFβ2基因、TGFβ2多肽及它們的應(yīng)用，尤其是作為乳腺癌新的分子分型標(biāo)志物的應(yīng)用。本發(fā)明首次證實(shí)了基因TGFβ2主要在三陰性乳腺癌中表達(dá)升高。同時(shí)在三陰性乳腺癌患者血清中也較其他分子分型的乳腺癌患者血清明顯升高。本發(fā)明不僅為乳腺癌分子分型提供了新的資料，而且為乳腺癌三陰性分子分型的檢測提供了新的靶點(diǎn)和一個(gè)血清學(xué)快速檢測方法。
【IPC分類】C12Q1/68, G01N33/68, C12N15/12, G01N33/574, C07K14/495
【公開號】CN105483134
【申請?zhí)枴緾N201510908487
【發(fā)明人】賀智敏, 鄭國沛, 張志杰, 賈小亭
【申請人】廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年12月10日