草魚耐糖性能相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利說明】草魚耐糖性能相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，尤其設(shè)及一種草魚耐糖性能相關(guān)的SNP標(biāo)記及 其應(yīng)用，屬于分子標(biāo)記領(lǐng)域。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 草魚（Ctenopharyngodon idella)屬雅羅魚亞科化 euciscinae)、草魚屬 (Ctenopha巧ngodon)，是我國淡水養(yǎng)殖魚類中年產(chǎn)量最大的養(yǎng)殖對象，因草魚生長速度快， 肉質(zhì)鮮美，深受人們喜愛。目前養(yǎng)殖草魚還有一定的效益空間，但從生產(chǎn)支出看，2008年W 來飼料成本不斷上漲，飼料成本占了草魚養(yǎng)殖的70% W上成本。因糖類屬于Ξ大營養(yǎng)物質(zhì) 中最廉價的供能物質(zhì)，生產(chǎn)中經(jīng)常增加糖的含量來降低飼料成本，雖然草魚屬于草食性魚 類，相對比雜食性魚類和肉食性魚類對糖利用能力高，但還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陸生畜禽類。飼料中 糖類水平超過一定限度，會引發(fā)魚類免疫力下降、生長緩慢、死亡率增高等癥狀。選育出可 高效利用高糖飼料的新品種可大幅度降低草魚養(yǎng)殖成本，因此，開發(fā)快速可靠的育種技術(shù)， 進(jìn)行草魚耐高糖品種(系）的培育也是十分必要。
[0003] 在開展常規(guī)選育研究的同時，開發(fā)和應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)可加快草魚良種 選育進(jìn)程。SNP是指基因組DNA序列中由于單個核巧酸變異而產(chǎn)生的多態(tài)性，位于基因編碼 區(qū)的非同義SNP可導(dǎo)致氨基酸的變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能，特別是發(fā)生在結(jié)構(gòu)功能區(qū)域 的SNP尤其重要，最終引起生物表型的變化。此外，在SNP標(biāo)記研究和應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，基因組上 相鄰SNPs的等位位點傾向W整體形式遺傳給后代，運種一組相關(guān)聯(lián)的SNPs等位位點被稱作 單倍型化aplotype)。為了更有效的鑒定與性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記，必須對整個基因序列 上的SNPs所構(gòu)成的單倍型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
[0004] 糖酵解是糖代謝的主要途徑之一，丙酬酸激酶（pyruvate kinase，PK，EC 2.7.1.40)是催化糖酵解的最后一步的關(guān)鍵酶，其催化憐酸締醇式丙酬酸(PEP)轉(zhuǎn)變?yōu)楸?酸，憐酸締醇式丙酬酸的高能憐酸鍵在催化下轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP。飼料中糖的含量與魚類 PK的活性密切相關(guān)。因此，綜合考慮PK在糖代謝過程中重要功能，開展草魚PK基因多態(tài)性的 研究很有必要。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[000引為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種草魚耐糖性能相 關(guān)、能夠有效用于鑒定或選育耐糖性能強的草魚的SNP標(biāo)記。本發(fā)明通過Bioedit2.0對樣品 的PKa序列進(jìn)行比對，找到2個完全連鎖的SNP標(biāo)記的位點，并進(jìn)一步分析運兩個SNP標(biāo)記組 成的基因型與草魚耐糖性能的關(guān)聯(lián)性，W達(dá)到快速鑒別或選育耐糖性強的草魚的目的。 [0006] 所述的兩個SNP標(biāo)記的位點分別命名為H3(T+1817C)和H4(G+1818T)，其中，H3(T+ 1817C)位于SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列（草魚PK基因片段）中自5/端起第1817位，且該 位置處堿基為T或C;H4(G+1817T)位于SEQ ID N0:1所示的核巧酸序列中自5/端起第1818 位，且該位置處堿基為G或T。上述兩個SNP位點完全連鎖組成Ξ種基因型：TTGG、TCGT和 CCTT，分別命名為ΑΑ,ΑΒ和BB，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基因型為AA(TTGG)的草魚耐糖能力顯著高于AB (TCGT)和BB(CCTT)草魚。因此，通過檢測草魚的上述SNP標(biāo)記的基因型，能夠有效確定其耐 糖性能，進(jìn)一步地，本發(fā)明的SNP標(biāo)記能夠有效用于草魚的分子標(biāo)記輔助育種。進(jìn)而能夠根 據(jù)實際育種需求對耐糖草魚進(jìn)行早期選擇，并可W大大節(jié)約時間、成本低廉，準(zhǔn)確性高。 [0007] 上述SEQ ID N0:1的核巧酸序列如下(XY表示兩個SNP位點）：
[000引
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供用于獲得上述SEQ ID N0:1所示核巧酸序列的引物對1， 所示引物對1具有SEQ ID N0:2-3所示的核巧酸序列，具體地，引物對1的序列如下：
[0010] 上游引物:GGCATCTTCCCCGTATTCT(SEQ ID N0:2)
[0011] 下游引物：CATCATCGTTCTCCTACTCAG(SEQ ID N0:3)
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測上述SNP標(biāo)記的引物對2,利用引物對2能 夠有效地對上述SNP標(biāo)記位點所在的片段進(jìn)行PCR擴增，達(dá)到快速檢測SNP標(biāo)記的基因型、降 低檢測成本的目的。所述引物對2具有SEQ ID N0:4-5所示的核巧酸序列，具體地，引物對2 的序列如下：
[0013] 上游引物:GCCACAGGACCGTAACGCACTC(沈Q ID N0:4)
[0014] 下游引物:GACAAGCGCACAGACAGCTCTGCTTTAATGAGTAACAACCATGGATGTA(SEQ ID NO: 5)
[0015] 本發(fā)明的另一目的是提供所述SNP標(biāo)記在鑒別或選育耐高糖草魚品種中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的另一目的是提供所述引物對1和引物對2在鑒別或選育耐高糖草魚品種 中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的另一目的是提供一種鑒定草魚耐糖性能的方法，具體包括W下步驟：
[001引（1)提取待測草魚的DNA;
[0019] (2)利用上述引物對1，將待測草魚的DNA進(jìn)行PCR擴增，W獲得SEQ ID N0:1所示的 核巧酸序列產(chǎn)物；
[0020] (3)利用上述引物對2,將SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列進(jìn)行PCR擴增，并在引物 對2的下游引物的5'端引入一個錯配堿基，W使其擴增產(chǎn)物可W被BsrGI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行 識別；
[0021] (4)利用BsrGI限制性內(nèi)切酶對步驟(3)獲得的擴增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物利用 瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下顯色，如果具有216bp單條譜帶，則其SNP標(biāo)記為AA(TTGG)基 因型，其對應(yīng)的草魚個體為耐高糖品種，有266bp和21化P兩條譜帶的為AB(TGCT)基因型，具 有266單條譜帶的為BB (CCTT)基因型，其對應(yīng)的草魚為非耐高糖品種。
[0022] 進(jìn)一步的，提取待測草魚DNA的方法不受特別限制，可W采用任何已知的DNA提取 方法或試劑盒進(jìn)行。本發(fā)明實施例中采用常規(guī)酪氯仿方法抽提待測草魚的DNA。
[0023] 進(jìn)行酶切的條件不受特別限制，本發(fā)明實施例中優(yōu)選的酶切體系為:d地2〇 4化L， 限制性內(nèi)切酶lul，PCR產(chǎn)物lul，10 XBuffer加1;酶切反應(yīng)條件優(yōu)選為37°C15min。
[0024] 進(jìn)一步的，瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)選條件為:2%瓊脂糖凝膠，100V，60min。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果：
[0026] 本發(fā)明利用分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的方法獲得草魚耐糖性能相關(guān)的SNP標(biāo)記， 依據(jù)丙酬酸激酶基因內(nèi)部產(chǎn)生的堿基突變，因此不存在遺傳的交換，也不需要表型的進(jìn)一 步驗證。利用本發(fā)明的標(biāo)記可W簡單快速的鑒定耐高糖草魚，同時也可W利用該標(biāo)記指導(dǎo) 選育耐糖草魚新品系。 【【具體實施方式】】
[0027] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。 在未作說明的情況下，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購的試劑、設(shè) 備和常規(guī)使用的方法。
[002引 實施例1
[0029] 1飼料準(zhǔn)備
[0030] 購買進(jìn)口魚粉、豆巧、酒糟、面粉、豆油、憐酸二氨巧、氯化膽堿、食鹽、預(yù)混料（多 維、多礦），在珠江水產(chǎn)研究所飼料廠將運些飼料原料混合均勻后，加適量的水?dāng)埌杈鶆?，?制粒機制成兩種顆粒大小為5mm左右的顆粒，將制好的顆粒飼料放入烘箱中，56°C恒溫干燥 2地，烘干后放入-20°C保存?zhèn)溆?。將烘干后的飼料送廣州分析測試中屯、檢測其主要成分，分 析結(jié)果見表1，運兩種飼料的糖含量分別為39.4g/100g和45.4g/100g，分別記為普通飼料和 高糖飼料。
[0031 ]表1實驗飼料的組成成分
[0032]
[0033] 2實驗魚養(yǎng)殖
[0034] 從現(xiàn)有的珠江水產(chǎn)研究所良種基地、廣東海大集團百容水產(chǎn)種苗有限公司草魚繁 育群體中，選取400尾體長、體質(zhì)量較為均勻的魚，體重為43±0.5g，隨機分成2組(普通組和 高糖組），每組200尾草魚，饑餓24小時后進(jìn)行初始體重的測量，并給每尾魚打入電子忍片標(biāo) 記后分別飼養(yǎng)在2個260cmX 300cmX 150cm的水