泥池內(nèi)。用巧巾不同糖水平的人工配合飼料 喂養(yǎng)8周，在飼養(yǎng)過程中，保持兩組魚的飼養(yǎng)條件基本一致，每天早晚各投喂一次，飼養(yǎng)過程 中做好病害預(yù)防工作和水質(zhì)調(diào)控管理。喂養(yǎng)結(jié)束W后，掃描電子忍片，記錄每尾魚的體質(zhì) 量，并剪取每尾魚的尾罐保存于無水乙醇中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。
[003引3樣品DNA的提取
[0036] (1)取待檢測魚的罐條組織3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液（lOmmol/L Tris-肥1; 0.1 mo 1/L EDTA; 0.5 % SDS; 30mg/L 歴ase; lOOmg/L蛋白酶K，P冊.0)，55°C消化 1 小時(shí)，其間 不時(shí)輕輕搖動(dòng)；
[0037] (2)加入等體積的酪/氯仿/異戊醇（25: 24:1)，顛倒混勻，室溫下靜置5分鐘后， 12000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、10分鐘，取上清液，再用氯仿抽提一次，室溫下靜置5分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分 鐘離屯、10分鐘，取上清液；
[0038] (3)加入2倍體積的無水乙醇，室溫靜置10分鐘沉淀DNA，12000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、10分 鐘；
[0039] (4)用70%乙醇洗涂1次，12000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、2分鐘，吸去上清，室溫靜置干燥10分 鐘，加入50μ1 TE(10mmol/L Tris-肥l;lmmol/L 邸TA，p冊.0)溶解DNA，4°C膽存?zhèn)溆谩?br>[0040] 4、草魚PK基因的獲取：利用引物對1，將待測草魚的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，W獲得SEQ ID N0:1所示的核巧酸序列，即草魚PK基因片段。
[0041 ] 本實(shí)施例中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：
[0042]
[0043] 反應(yīng)條件為：（1 )94°C預(yù)變性4min，（2)94°C變性30s，（3)57°C退火30s，（4)72°C延 伸 453;(5)循環(huán)步驟2)~4)32次，（6)72°(3延伸7111111。
[0044] 5、SNP標(biāo)記基因片段擴(kuò)增:利用上述引物對2,將SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，并在引物對2的下游引物的5'端引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，W使其擴(kuò)增產(chǎn)物可W被 BsrGI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行識別。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同4,引物對2對應(yīng)的DNA片段 位置如下，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為26化P。
[004引 上游引物:GCCACAGGACCGTAACGCACTC [0046]
[0049] 注:方框內(nèi)的堿基為人工引入的錯(cuò)配堿基，XY為兩個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)H3(T+1817C)和 H4(G+1818T)，X處為T或G，Y處為C或T。
[0050] 6、基因型判定
[0051 ] 利用BsrGI限制性內(nèi)切酶對上述5中的26化P擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切（本實(shí)施例優(yōu)選的 酶切體系為:d地2〇 4化L，限制性內(nèi)切酶lul，PCR產(chǎn)物lul，10 XBuffer加1;酶切反應(yīng)條件 為37°C15min)。酶切產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠，于100V，60min條件下電泳，在紫外燈下顯色。 [0052] 由于上述兩個(gè)SNP位點(diǎn)完全連鎖，H3(T+1817C)和H4(G+1818T)組成Ξ種基因型AA (TTGG)、AB(TGCT)和BB(CCTT)，而BsrGI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)為
因 此，AA基因型的所有核巧酸鏈均具有酶切位點(diǎn)，得到的酶切產(chǎn)物包括21化P片段和50bp片 段;AB基因型的一部分部分核巧酸鏈具有酶切位點(diǎn)，另一部分核巧酸鏈沒有酶切位點(diǎn)，酶切 產(chǎn)物包括26化P片段、216bp片段和50bp片段；而BB基因型不具有酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物只有 266bp片段。因?yàn)?66bp和21化P差異較小，為了用瓊脂糖進(jìn)行完全區(qū)分，電泳時(shí)間需要跑 60min，50bp片段已經(jīng)跑出凝膠外，所W在凝膠圖譜上觀察到AA基因型為21化P單條譜帶;AB 基因型為266bp和216bp雙條譜帶;BB基因型為266bp單條譜帶。所W根據(jù)各草魚的凝膠圖譜 判定其SNP標(biāo)記位點(diǎn)的基因型，并利用化pgene(Versions.2)分析處理等位基因頻率(等位 基因頻率=等位基因的樣本數(shù)/總樣本數(shù)），統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。
[0053] 表2 SNP位點(diǎn)在兩組草魚群體中的基因型頻率
[0054]
[0055] 7、SNP標(biāo)記的基因型與草魚耐糖性能的關(guān)聯(lián)性驗(yàn)證
[0056] 根據(jù)前期記錄的每尾魚的體質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)分析所述草魚PKa基因中SNP標(biāo)記位點(diǎn)的基 因型與草魚耐糖性能的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表3所示。在飼喂普通飼料的群體中，不同基因型在體 質(zhì)量上差異不顯著(P〉〇.05)，但AA型增重率分別比AB型和BB型高4.9%和6.1%。而在飼喂 高糖飼料的群體中，基因型AA的體質(zhì)量顯著大于AB型和BB型(P<0.05)，AA型的增重率分別 比AB型和BB型高36.8%和30.4%，48型和88型無之間無顯著差異?！?.05)。說明具有八八 (TTGG)基因型的草魚耐糖能力比較強(qiáng)，與預(yù)期一致。
[0057] 表3 SNP標(biāo)記的基因型與草魚耐糖性能的關(guān)聯(lián)性 [005引
[0059] W上所述，僅為本發(fā)明的較佳的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明掲露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 構(gòu)思加 W等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種草魚耐糖性能相關(guān)SNP標(biāo)記，其特征在于，包括兩個(gè)SNP位點(diǎn)H3和H4，所述H3位于 SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列中自5'端起第1817位，且該位置處堿基為T或C;所述H4位于 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中自5'端起第1818位，且該位置處堿基為G或T。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記，其特征在于，TTGG基因型個(gè)體的耐糖能力顯著高于 TCGT基因型和CCTT基因型個(gè)體。3. -種用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述SEQ ID N0:1核苷酸序列的引物對1，其特征在于，所述 引物對1具有SEQ ID NO:2-3所示的核苷酸序列。4. 一種用于檢測上述SNP標(biāo)記的引物對2,其特征在于，所述引物對2具有SEQ ID N0:4-5所示的核苷酸序列。5. 權(quán)利要求1或2所述SNP標(biāo)記在鑒別或選育耐高糖草魚品種中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求3所述引物對1在鑒別或選育耐高糖草魚品種中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求4所述引物對2在在鑒別或選育耐高糖草魚品種中的應(yīng)用。8. -種鑒定草魚是否為耐高糖品種的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取待測草魚的DNA; (2) 利用上述引物對1，將待測草魚的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得SEQ ID NO: 1所示的核苷 酸序列產(chǎn)物； (3) 利用上述引物對2，將SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在引物對2的 下游引物的5'端引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，以使其擴(kuò)增產(chǎn)物可以被BsrGI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行識別； (4) 利用BsrGI限制性內(nèi)切酶對步驟(3)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物利用瓊脂 糖凝膠電泳并在紫外燈下顯色，如果具有216bp單條譜帶，其對應(yīng)的草魚個(gè)體為耐高糖品 種;如果具有266bp和216bp兩條譜帶或266單條譜帶，其對應(yīng)的草魚個(gè)體為非耐高糖品種。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的鑒定草魚是否為耐高糖品種的方法，其特征在于，所述步驟 (4)中，酶切體系為:ddH20 43yL，限制性內(nèi)切酶lul，PCR產(chǎn)物lul，10 XBuffer 5ul，反應(yīng)溫 度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為15min。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的鑒定草魚是否為耐高糖品種的方法，其特征在于，所述步驟 (4)中，酶切產(chǎn)物利用2 %瓊脂糖凝膠，在100V條件下電泳60min。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種草魚耐糖性能相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，包括兩個(gè)SNP位點(diǎn)H3和H4，所述H3位于SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列中自5′端起第1817位，且該位置處堿基為T或C；所述H4位于SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列中自5′端起第1818位，且該位置處堿基為G或T。本發(fā)明的SNP標(biāo)記與草魚耐糖性能密切相關(guān)，能夠有效用于鑒定或選育耐高糖的草魚品種。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105505927
【申請?zhí)枴緾N201610063828
【發(fā)明人】樊佳佳, 白俊杰, 朱冰, 全迎春, 姜鵬, 李勝杰, 馬冬梅
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月29日