大豆磷饑餓負調(diào)控基因GmSPX1、編碼蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXI、編 碼蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在植物生長發(fā)育所必須的17種元素中，憐元素(P)是非常重要的一種。包括核糖核 酸(Nucleic acids)合成、細胞膜(Membrane)構(gòu)建和ATP合成等在內(nèi)的植物細胞活動中都離 不開P元素。甚至有很多參與酶促反應(yīng)和信號傳導過程的復合物中也都必須含有P元素。植 物根只能W吸收±壤中無機憐酸鹽(Pi)的方式來獲取所必須的P元素。然而由于±壤所帶 電荷為負，所WPi就很容易浸出，而且±壤中大多數(shù)的Pi不是被微生物轉(zhuǎn)化為有機化合物， 就是通過與陽離子相互作用變得不溶于水，結(jié)果就是大量的P被固定在±壤中無法被植物 所利用。因此，為確保農(nóng)作物的產(chǎn)量，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中就會使用大量的憐肥，但是，運種做法受 到越來越多的關(guān)注和質(zhì)疑，運不僅是經(jīng)濟層面上的問題，更是一個生態(tài)環(huán)境上的問題，一是 因為憐肥會對環(huán)境造成污染;二是因為要保持憐資源的可持續(xù)性利用。所W近年來在農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)過程中為了提高憐的利用效率，一般從運兩個方面來入手，第一，優(yōu)化±壤中P元素的 濃度;第二，培育在缺憐條件下依舊可W保證產(chǎn)量的憐高效作物。故此，在分子生物學層面 上研究植物是如何感知和響應(yīng)外界Pi含量變化的非常重要。
[0003] 盡管口1在±壤中的含量差異很大，但是植物細胞內(nèi)Pi的濃度是能夠被嚴格調(diào)控并 保持在一個相對穩(wěn)定的平衡中的。因為植物在長久的進化過程中，已經(jīng)發(fā)展出一系列的協(xié) 調(diào)策略，包括節(jié)約利用、循環(huán)利用和提高從外界環(huán)境中吸收Pi的能力等。近年來，雖然對憐 饑餓相關(guān)的生物化學和形態(tài)學方面的研究已經(jīng)取得了一些實質(zhì)性的進展，然而由于有非常 多的代謝通路參與了憐酸鹽調(diào)控，而且運些通路往往又非常復雜多變，所W我們對植物是 如何感知外界環(huán)境中Pi濃度變化，又是如何正確地進行信號傳導等問題的了解依舊非常有 限。
[0004] 在植物中可W把包含SK(結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)分為四大類。第一類，只包含有SK(結(jié)構(gòu) 域的蛋白；第二類，除了 SPX結(jié)構(gòu)域，在C末端還包含有一個EXS結(jié)構(gòu)域的蛋白；第Ξ類，除了 SPX結(jié)構(gòu)域，在C末端還包含有一個肥S結(jié)構(gòu)域的蛋白；第四類，除了 sra結(jié)構(gòu)域，在C末端還包 含有一個RING結(jié)構(gòu)域的蛋白。
[0005] 第一類在擬南芥中報道有4個蛋白（AtSPXl-AtSPX4)、水稻中報道有6個蛋白 (OsSPXl-OsSPXe)、大豆中報道有9個蛋白（GmSPXl-GmSPX9)、菜豆中報道3個蛋白（PvSPXl-PvSPX3);通過對運些基因的亞細胞定位和組織表達分析發(fā)現(xiàn)，它們在植物的根、莖、葉、子 葉、花粉、細胞核和胞漿中都有表達;除了擬南芥中的AtSPX4和水稻中的0sSPX4,其他基因 在低憐環(huán)境下都會被誘導表達;在AtSPXl、AtSPX2和AtSPX4突變體株系中，不管是在低憐脅 迫環(huán)境還是在正常環(huán)境下都沒有觀察到明顯的表型變化，而在spxl/spx2雙突變體中觀察 到Pi的大量積累；在最近的研究中發(fā)現(xiàn)AtSPXl可W與AtPHRl互作，形成蛋白復合物;在上文 中提到，AtP皿1在憐饑餓響應(yīng)中起到中屯、調(diào)控的作用，它可W識別并結(jié)合在很多憐饑餓相 關(guān)基因啟動子的PIBS位點上，激活運些基因表達來緩解憐饑餓對植物造成的影響;AtSPXl 的表達可W受到憐饑餓脅迫不斷升高，它自身的啟動子區(qū)域中也包含有P1BS元件，可W被 P皿1所識別并激活，但是AtSPXl又可W與A巧HR1結(jié)合形成SPX1/PHR1復合物，并抑制A巧皿1 的轉(zhuǎn)錄激活活性，導致AtPHRl下游的很多基因（包括AtSPXl)的表達受到抑制，W起到調(diào)控 植物自身Pi動態(tài)平衡的作用，運與之前作者在2008年提到的在過表達AtSPXl擬南芥株系中 發(fā)現(xiàn)ACP5、PAP2和RNS1基因表達量顯著升高的結(jié)果有些矛盾，但是作者并沒有給出明確的 解釋;AtSPX3則被認為在擬南芥憐饑餓響應(yīng)中起到負調(diào)控作用，AtSPX3的表達被干擾后很 多PSI基因的表達會上調(diào)，植株全憐含量也大幅上升，甚至出現(xiàn)憐中毒的現(xiàn)象。
[0006] 在對水稻OsSPX的研究中也得到了類似的結(jié)果；雖然0sSPX4在憐饑餓脅迫的條件 下表達量并沒有明顯的變化，但是發(fā)現(xiàn)0SSPX4突變體中PSI基因的表達量卻顯著升高，植物 全憐含量也會大幅升高;酵母雙雜實驗和BiFC等實驗發(fā)現(xiàn)0sSPX4可W與OsP皿2互作，并且 在正常憐環(huán)境下0sSPX4可W抑制OsP皿2的活性，但在低憐環(huán)境下0sSPX4會通過蛋白酶體途 徑而被降解失活；最近的報道中也發(fā)現(xiàn)，OsSPXl和0sSPX2有類似的作用，在正常憐環(huán)境下 0sSPXl/0sSPX2與OsP皿2是高親和的，而在憐饑餓脅迫下0sSPXl/0sSPX2與0sPHR2就會變成 低親和的；在對0sSPX3和0sSPX5的研究中發(fā)現(xiàn)，它們不僅可W負向調(diào)控水稻Pi從地下部到 地上部轉(zhuǎn)運的過程，而且還可W抑制0SPHR2的表達，但目前尚未有直接的互作證據(jù)。
[0007] 在菜豆的研究中發(fā)現(xiàn)，PvSPXl在憐響應(yīng)過程中起正向調(diào)控的作用，過表達PvSPXl 的菜豆根中，PSI基因的表達會大幅上調(diào)，全憐含量也會提高，而且發(fā)現(xiàn)其根毛的發(fā)育會被 激活。在過表達PvPHRl的菜豆根中，P^PXl的表達量大幅上升，說明PvSPXl的表達可W被 PvPHRl激活。在大豆中GmSPX3也被證實在大豆的憐饑餓響應(yīng)中起正向調(diào)控的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引1、發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供該基因所編碼的蛋白。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述基因的重組質(zhì)粒。
[0012] 本發(fā)明的又一個目的是提供上述基因或重組質(zhì)粒在調(diào)控大豆體內(nèi)憐代謝平衡及 培育憐高效利用大豆品種中的應(yīng)用。
[001引2、技術(shù)方案
[0014] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0015] 一種大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl，其核巧酸序列如序列表Seq ID NO. 1所示。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl所編碼的蛋白，其氨基酸序列 如序列表Seq ID NO.2所示。
[0017] 進一步地，本發(fā)明提供了一種含有該大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl的重組質(zhì)粒， 是將大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl插入祀arleygate 103植物過量表達載體和融合表達載 體P J 口-166-GFP中而成的。
[0018] 進一步地，本發(fā)明提供了擴增所述大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl全長或其任意片 段的引物對，該引物對的上游引物如序列表Seq ID No.3所示，下游引物如序列表Seq ID No. 4所示。
[0019] 進一步地，本發(fā)明提供了所述的大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl或所述重組質(zhì)粒在 調(diào)控大豆體內(nèi)憐代謝平衡中的應(yīng)用。
[0020] 進一步地，本發(fā)明提供了所述的大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl或所述重組質(zhì)粒在 培育憐高效利用大豆品種中的應(yīng)用。
[0021] 進一步地，本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，就是將所述憐饑餓負調(diào)控 基因 GmSPXl通過重組質(zhì)粒導入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物相比于目的植 物全憐含量明顯減少，憐饑餓相關(guān)基因顯著下調(diào)。
[0022] 3、有益效果
[0023] (1)本發(fā)明所提供的大豆憐饑餓負調(diào)控基因 GmSPXl,位于第1條染色體上，讀碼框長 度為786bp;其編碼的蛋白僅包含有一個SPX結(jié)構(gòu)域，屬于大豆GmSPX家族成員；利用任何一 種可W引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明GmSPXl基因?qū)胫参锛毎?，可獲得全 憐含量明顯減少，憐饑餓相關(guān)基因顯著下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株；
[0024] 間使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何一 種增強啟動子或誘導型啟動子;為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對 所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、蛋光素酶基因等)或具有抗性 的抗生素標記物(慶大霉素、卡那霉素等）；
[0025] 間攜帶有本發(fā)明GmSPXl的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直 接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導、