550nm，葉綠體自發(fā)巧光(激發(fā)波長為488nm)，實驗中每個結(jié)果重復(fù)3次~6次。
[0115] 如圖10所示，發(fā)現(xiàn)在正常憐和低憐條件下，0XSPX1根尖中的綠色巧光的亮度和巧 光值明顯比WT高，也就是說其根尖組織中積累了大量的過氧化氨，說明過表達(dá)GmSPXl會導(dǎo) 致擬南芥體內(nèi)活性氧的大爆發(fā)。
[0116] 實施例8: GmSPXl的亞細(xì)胞定位
[0117] (l)GmSPXl 的亞細(xì)胞定位所使用的載體為 pj 口-166-GFP，pJ 口-166-GFP-GmSPXl 載 體的構(gòu)建方法為雙酶切法，設(shè)計特異性引物，力陽ind III、BamH I酶切位點和保護(hù)堿基。
[011引特異性引物為：
[0119] Seq ID NO. 11:上游引物如下
[0120] 5 '-CCCAAGCTTATGAAGTTTGGGAAGAGACTCAAGC-3 '；
[0121] Seq ID NO. 12:下游引物如下
[01。] 5 '-CGCGGATCCAGGGAGGAGGAAAATGGAAAT-3 '；
[0123] 經(jīng)過PCR反應(yīng)程序及PCR產(chǎn)物回收，然后對PCR產(chǎn)物回收和空載pJIT-166-GFP進(jìn)行 雙酶切，回收純化正確的片段進(jìn)行連接。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落，培養(yǎng)后進(jìn)行 測序，選取正確測序結(jié)果提取質(zhì)粒，獲得pj 口-166-GFP-GmSPXl質(zhì)粒(如圖5B所示），并進(jìn)行 雙酶切檢測再次檢驗質(zhì)粒是否正確，瓊脂糖凝膠電泳獲得了與目的基因大小一致的條帶， 證實實驗結(jié)果真實可信(如圖3C所示）。
[0124] (2)使用基因槍轟擊洋蔥內(nèi)表皮和PEG轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體兩種方法來探究 GmSPXl在植物細(xì)胞中的定位。
[0125] A.基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮法，具體步驟如下：
[0126] 步驟一:使用新鮮洋蔥，將其鱗莖切成適量大小，剝?nèi)?nèi)表皮迅速貼到等滲的MS培 養(yǎng)基上，倒置25°C暗培養(yǎng)過夜；
[0127] 步驟二：制備微彈：在1.5mL的無菌離屯、管中加入8.化L金粉，滿旋2min，使其均勻 懸浮;在該管中依次加入扣L質(zhì)粒DNA(1μg/μL)，10yL CaCl2(2.5M)，4化亞精胺(0.1M)，滿旋 2-3min充分混勻，4°C靜置10min;10000rpm離屯、10s，棄上清，加入140yL70%乙醇，滿旋 2min;重復(fù)上一步;加入10化無水乙醇重懸，充分混勻；
[0128] 步驟基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，通過基因槍將包裹DNA的金粉微彈轟擊至洋蔥 表皮細(xì)胞中，25°C暗培養(yǎng)20h后，將洋蔥表皮置于載玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡觀察綠 色巧光的位置。
[0129] B.擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，具體步驟如下：
[0130] 試劑配制，現(xiàn)用現(xiàn)配：
[01；31]酶液：1.5%cellulase R10,0.3%macerozyme R10,0.4M甘露醇，20Mm KCl，20mM MES(P冊.7)，lOmM CaCb，0.1 %BSA，溶解后用0.45μΜ濾膜過濾后備用，lOmL酶液可酶解15 片左右的葉子。
[0132] 陽G4000溶液：40 %陽G4000，0.2M甘露醇，lOOmM CaCl2，用dd出0補齊后，在250rpm 的搖床上震蕩混勻l〇-15min，靜止30min左右。
[0133] W5溶液：2mM MES(PH 5.7)，154mM 化Cl，125mM CaCl2,5mM KC1，溶解后用0.45μπι 濾膜過濾后備用。
[0134] ]\^6溶液：4111]\1165(抑5.7)，0.4]\1甘露醇，15111]\11旨(：12，溶解后用0.454]\1濾膜過濾 后備用。
[01巧]步驟一:分離原生質(zhì)體：
[0136]選用3-4周大小還未抽苔的幼苗，剪取健康新鮮圓潤的葉片，使用鋒利的手術(shù)刀將 葉片的葉尖和葉柄切除，然后迅速將葉片W垂直葉脈的方向切成0.5-lmm的小條，并放入酶 液中（酶液用玻璃培養(yǎng)皿盛放，避免強光照射），然后置于25°C搖床中，6化pm避光震蕩3小時 左右，直至葉片全部酶解，如有少許葉條剩余，可W用力震蕩酶液W將原生質(zhì)體完全釋放出 來。
[0137 ] 步驟^:感雙態(tài)制備：
[0138] 準(zhǔn)備滅菌的50mL圓底離屯、管和200目的紗布，將紗布折成漏斗狀，用W5潤洗后，將 上述原生質(zhì)體-酶液緩慢的過濾至離屯、管中；300g/lmin離屯、沉淀原生質(zhì)體，盡量去除上清 后用5-lOmL預(yù)冷的W5輕柔重懸，后在冰上靜置30min;室溫中，300g/5分鐘離屯、沉淀原生質(zhì) 體，小屯、去除上清；用適量MMG溶液重懸原生質(zhì)體，終濃度控制在2 X 105個/mL。
[0139] 步驟質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：
[0140] 分別將lOyg高濃度質(zhì)粒（化邑/化)加入到2mL離屯、管中，再緩慢加入100化原生質(zhì)體 輕柔混合;緩慢加入11化L陽G溶液，輕柔彈撥離屯、管底至混勻；黑暗誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化15分鐘；用室 溫下的W5加滿離屯、管W稀釋轉(zhuǎn)化液，混勻W終止轉(zhuǎn)化;300g/min沉淀原生質(zhì)體，去除上清后 再加 ImL W5溶液清洗一次。
[0141] 步驟四：原生質(zhì)體解育和鏡檢：
[0142] 用ImL W5溶液輕柔重懸原生質(zhì)體，移入0.1%BSA潤洗過的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，室 溫避光培養(yǎng)15-18小時;在激光共聚焦下觀察綠色巧光在細(xì)胞中的分布。
[0143] 觀察結(jié)果如圖11所示，a為GmSPXl-GFP在洋蔥細(xì)胞中表達(dá);b為GmSPXl-GFP在擬南 芥原生質(zhì)體中表達(dá);C為空載在洋蔥細(xì)胞中表達(dá);d為空載在擬南芥原生質(zhì)體中表達(dá)，可W看 出GmSPXl-GFP巧光信號很強，綠色巧光遍布整個細(xì)胞內(nèi)，說明GmSPXl所編碼的蛋白在整個 植物細(xì)胞中都有分布。
【主權(quán)項】
1. 一種大豆磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl，其特征在于，所述磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl的 核苷酸序列如序列表Seq ID NO. 1所示。2. -種權(quán)利要求1所述的磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl所編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋 白的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示。3. -種含有權(quán)利要求1所述的磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述 重組質(zhì)粒是將權(quán)利要求1所述的磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl插入pEarleygatel03植物過量表 達(dá)載體和融合表達(dá)載體P JIT-166-GFP中而成的。4. 擴增權(quán)利要求1所述磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl全長或其任意片段的引物對，其特征 在于，所述引物對的上游引物如序列表Seq ID No.3所示，下游引物如序列表Seq ID No.4 所示。5. 權(quán)利要求1所述磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl或權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒在調(diào)控大豆體 內(nèi)磷代謝平衡中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl或權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒在培育磷高效 利用大?品種中的應(yīng)用。7. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述方法是將權(quán)利要求1所述磷饑餓負(fù)調(diào) 控基因 GmSPXl導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物相比于目的植物全磷含量 明顯減少，磷饑餓相關(guān)基因顯著下調(diào)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中磷饑餓負(fù)調(diào)控基因 GmSPXl是通 過權(quán)利要求3所述的重組載體導(dǎo)入目的植物的。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種磷饑餓負(fù)調(diào)控基因GmSPX1、編碼蛋白及其應(yīng)用。該基因的核苷酸序列如Seq？ID？NO.1所示。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過任何一種可以導(dǎo)入外源基因GmSPX1的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可獲得過表達(dá)GmSPX1的轉(zhuǎn)基因植株，與未轉(zhuǎn)基因植株相比其全磷含量明顯減少，磷饑餓相關(guān)基因顯著下調(diào)，根系統(tǒng)形態(tài)也發(fā)生明顯改變，突變體磷中毒現(xiàn)象得到緩解。本發(fā)明公開的基因可作為目的基因?qū)胫参铮岣咿D(zhuǎn)基因植物磷體內(nèi)代謝平衡的能力，對培育磷高效利用大豆品種有重要意義。
【IPC分類】C12N15/11, A01H5/00, C12N15/29, C12N15/82, C07K14/415
【公開號】CN105505948
【申請?zhí)枴緾N201511024983
【發(fā)明人】楊守萍, 張璟曜, 周汐, 韓少懷, 姚敏磊
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月30日