具有嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒的制作方法
【專利說明】具有嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年7月8日提交的歐洲專利申請?zhí)?3175637.1的權(quán)益。上述申請的 全部教導(dǎo)內(nèi)容通過引用納入本文。
[0003] 序列表
[0004] -同提交序列表的電子版本，其通過引用納入本文并形成該提交申請的部分。
[0005] 政府支持
[0006] 本發(fā)明是在美國政府支持下由國家衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)授予的基金號P01-GM062580和AI-89618資助完成。美國政府享有本發(fā)明的一定權(quán) 利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0007] 本發(fā)明設(shè)及輪狀病毒顆粒用于展示單獨形式或與其它分子的復(fù)合物形式的異源 蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明還設(shè)及采用冷凍電子顯微鏡(冷凍EM)，利用運些經(jīng)修飾的輪狀病毒顆 粒W快速確定所述異源蛋白或所述復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明還設(shè)及使患者免疫的方 法，其中所述方法包括:給予所述患者本發(fā)明的經(jīng)修飾的輪狀病毒顆粒。
[000引背景
[0009] 呼腸病毒科(Reoviridae)家族包括結(jié)構(gòu)相關(guān)的一組病毒。該病毒家族的成員可造 成哺乳動物與鳥類的腸胃系統(tǒng)和呼吸道感染。該家族的一些病毒還能感染植物。
[0010] 所述呼腸病毒科是無包膜、雙鏈RN病毒，其由二十面體衣殼形成，該衣殼通常由蛋 白質(zhì)外層和一個或多個蛋白質(zhì)內(nèi)層組成。輪狀病毒(Rotavirus)屬形成呼腸病毒科家族的 部分。輪狀病毒形成Ξ層的病毒顆粒。輪狀病毒顆粒的外層由殼蛋白VP7,和纖突蛋白VP4組 成；中層由VP6組成;而內(nèi)層由VP2組成。所述Ξ層的病毒顆粒在通過膜蛋白酶激活之后是感 染性的。在輪狀病毒細(xì)胞侵入過程中，所述病毒顆粒的外層經(jīng)由出芽"脫殼"機(jī)制移除，從而 雙層顆粒侵入胞質(zhì)。在細(xì)胞侵入過程中，輪狀病毒穿透細(xì)胞膜，或可能穿透內(nèi)體膜。所述雙 層輪狀病毒顆粒具有轉(zhuǎn)錄活性。在胞質(zhì)中，其轉(zhuǎn)錄基因組，通過其表面的孔擠出mRNA。新轉(zhuǎn) 錄本被用于制備輪狀病毒蛋白質(zhì)和新雙鏈RNA基因組區(qū)段，其被包裝成新形成的病毒顆粒。
[0011] 對于一些呼腸病毒，脫殼過程可采用純化的病毒顆粒體外刺激。在輪狀病毒的情 況中，巧馨合或熱激會造成病毒顆粒的體外脫殼。一旦移除了外部蛋白質(zhì)層，所得的輪狀病 毒雙層顆粒能夠被重組表達(dá)形式的形成外層的蛋白質(zhì)"再包被"。通過用重組VP4和VP7再包 被，能夠形成非常類似成熟病毒粒的感染性的再包被的輪狀病毒顆粒。通過用單獨的VP7再 包被，能夠形成感染性最小的、Ξ層的、無纖突顆粒。通過對外層的個體蛋白質(zhì)的編碼區(qū)進(jìn) 行遺傳修飾并使其重組表達(dá)，能夠在再包被實驗中研究形成所述外層的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，而 不需要產(chǎn)生完全重組病毒。為了描述運些類型的實驗，引入術(shù)語"再包被遺傳學(xué)"。
[0012] 對于呼腸孤病毒，感染性的亞病毒顆粒的亞穩(wěn)態(tài)已允許采用冷凍電子顯微鏡(冷 凍EM)來闡明呼腸孤病毒進(jìn)入其宿主細(xì)胞的潛在機(jī)制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。類似地，已采用冷凍EM， 利用體外再包被的輪狀病毒顆粒來研究輪狀病毒組裝和脫殼的分子相互作用。本發(fā)明建立 于通過運些再包被和冷凍EM研究所帶來的先進(jìn)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 高分辨率冷凍與再包被遺傳學(xué)的結(jié)合使其能夠超越輪狀病毒本身的研究而使 輪狀病毒模型的應(yīng)用更加先進(jìn)。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒顆?？捎糜趯φ故驹诮?jīng)修飾的輪 狀病毒顆粒的表面上的異源性Ξ聚體蛋白質(zhì)進(jìn)行快速結(jié)構(gòu)測定。經(jīng)修飾W在其表面上展示 異源性Ξ聚體蛋白質(zhì)的輪狀病毒顆粒也有利于生產(chǎn)眾多的新型疫苗。
[0014] 本發(fā)明提供包含嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒，所述嵌合表面蛋白由連接至異源 蛋白的輪狀病毒表面蛋白組成。在本發(fā)明的一個方面，所述輪狀病毒表面蛋白通過接頭序 列連接至所述異源蛋白。在本發(fā)明的另一個方面中，所述輪狀病毒表面蛋白通過銜接子系 統(tǒng)(adapter system)連接至所述異源蛋白。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，所述異源蛋白通過 兩部分型（two-part)銜接子系統(tǒng)非共價地結(jié)合至所述輪狀病毒表面蛋白，其中，所述銜接 子系統(tǒng)的一部分連接至所述輪狀病毒表面蛋白，并且所述銜接子系統(tǒng)的另一部分連接至所 述異源蛋白，其中所述銜接子系統(tǒng)的運兩部分形成穩(wěn)定的復(fù)合物，因此將所述異源蛋白非 共價地連接至所述輪狀病毒表面蛋白。所述嵌合表面蛋白可通過對其體外再包被雙層輪狀 病毒顆粒(DLP)成為所述輪狀病毒顆粒的外層。
[0015] 本發(fā)明還提供包含如下開放閱讀框的第一核酸，該開放閱讀框編碼含有輪狀病毒 表面蛋白、第一銜接多膚和任選的接頭序列的經(jīng)修飾的輪狀病毒表面蛋白。本發(fā)明還提供 包含如下開放閱讀框的第二核酸，該開放閱讀框編碼包含異源蛋白、第二銜接多膚和任選 的接頭序列的融合蛋白。第一銜接多膚和第二銜接多膚能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物。通常，本發(fā) 明核酸中的開放閱讀框操作性地連接至啟動子序列。在一些實施方式中，所述銜接多膚包 含屯膚重復(fù)序列。還提供包含本發(fā)明的核酸的細(xì)胞。所述核酸和包含所述核酸的細(xì)胞可用 于制備本發(fā)明的嵌合表面蛋白。
[0016] 本發(fā)明還設(shè)及包含本發(fā)明的第一和第二核酸序列的試劑盒。在一些實施方式中， 本發(fā)明的試劑盒可包含第一核酸和第二核酸，第一核酸編碼經(jīng)修飾的輪狀病毒表面蛋白， 所述經(jīng)修飾的輪狀病毒表面蛋白包含輪狀病毒表面蛋白和第一銜接多膚，第二核酸包含編 碼第二銜接多膚和多克隆位點的核巧酸序列，由此在多克隆位點插入異源蛋白的編碼區(qū)能 產(chǎn)生編碼融合蛋白的開放閱讀框，所述融合蛋白包含所述異源蛋白和第二銜接多膚，其中， 第一銜接多膚和第二銜接多膚能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物。本發(fā)明的試劑盒還可包含輪狀病毒 顆粒。所述輪狀病毒顆?？稍醋暂啝畈《镜南嗤锓N，所述輪狀病毒表面蛋白源自該相同 物種或來自不同物種。例如，恒河猴輪狀病毒VP7可用于再包被由牛輪狀病毒制備的化P，反 之亦然。
[0017] 包含嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆?？赏ㄟ^多種方法制備。本發(fā)明的優(yōu)選方法設(shè) 及:在培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中繁衍包含外層的天然輪狀病毒顆粒，從所述培養(yǎng)基純化所述 顆粒，從所述顆粒移除外層W獲得輪狀病毒DLP，和用一種或多種嵌合表面蛋白再包被所述 輪狀病毒化P，W形成包含一種或多種所述嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒。天然輪狀病毒顆 粒是Ξ層的顆粒，其中，最外側(cè)的第Ξ層形成所述輪狀病毒顆粒的外殼。
[0018] 在一個具體方面，本發(fā)明設(shè)及第一融合蛋白，其包含形成Ξ聚體的輪狀病毒表面 蛋白、屯膚重復(fù)序列，和任選的接頭序列。本發(fā)明還提供第二融合蛋白，所述第二融合蛋白 包含形成Ξ聚體的異源蛋白、屯膚重復(fù)序列，和任選的接頭序列。第一融合蛋白和第二融合 蛋白通過其中各自包含的屯膚重復(fù)序列能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在一些實施方式中，本發(fā) 明提供由第一融合蛋白和第二融合蛋白形成的嵌合表面蛋白。所述嵌合表面蛋白可在輪狀 病毒顆粒的表面上展示。
[0019] 在本發(fā)明的一個方面，包含嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆?？捎糜诖_定形成所述嵌 合表面蛋白的部分的異源蛋白的結(jié)構(gòu)。例如，本發(fā)明提供用于獲得嵌合表面蛋白的Ξ維模 型的方法，其中，所述方法包括如下步驟：（i)用包含全部或部分異源蛋白的嵌合表面蛋白 再包被輪狀病毒化PW產(chǎn)生展示所述嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒的懸液，（ii)冷凍所述 懸液，（iii)采用冷凍EM對所述輪狀病毒顆粒成像W獲得多張顯微照片，和（iv)分析所述多 張顯微照片W獲得所述嵌合表面蛋白的Ξ維模型。在一些實施方式中，步驟(i)可細(xì)分為兩 個步驟，即，（a)再包被步驟，其中，所述輪狀病毒DLP用輪狀病毒表面蛋白再包被，所述輪狀 病毒表面蛋白包含第一銜接子W形成輪狀病毒顆粒，和(b)結(jié)合步驟，其中，所述再包被的 輪狀病毒化P在異源蛋白的存在下解育，所述異源蛋白包含第二銜接子，由此形成第一銜接 子和第二銜接子的復(fù)合物，從而使嵌合表面蛋白展示在所述輪狀病毒顆粒的表面上。在一 些情況中，所述方法可經(jīng)修改W確定與特異性結(jié)合至所述異源蛋白的分子結(jié)合的異源蛋白 的結(jié)構(gòu)。所述經(jīng)修改的方法包括如下步驟：（i)用包含全部或部分異源蛋白的嵌合表面蛋白 再包被輪狀病毒化PW產(chǎn)生展示所述嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒的懸液，（ii)向該懸液 添加特異性結(jié)合至所述異源蛋白的分子，其中，所述分子與所述嵌合表面蛋白形成復(fù)合物， (iii)冷凍所述懸液，（iv)采用冷凍EM對所述輪狀病毒顆粒成像W獲得多張顯微照片，和 (V)分析所述多張顯微照片W獲得與所述分子復(fù)合的嵌合表面蛋白的Ξ維模型。所述分子 可W是蛋白質(zhì)分子。例如，該蛋白質(zhì)分子可W是特異性結(jié)合所述異源蛋白的受體或抗體的 全部或部分。或者，所述蛋白質(zhì)分子可W是特異性結(jié)合至所述異源蛋白的多膚或膚。在其它 實施方式中，所述分子是非蛋白質(zhì)分子。例如，所述非蛋白質(zhì)分子可W是核酸。
[0020] 在另一個方面中，根據(jù)本發(fā)明制備的輪狀病毒顆粒被用作藥物。在一個實施方式 中，本發(fā)明設(shè)及一種免疫原性組合物，其包含含有本發(fā)明的嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒。 本發(fā)明還設(shè)及一種治療有此需要的患者的方法，所述方法包括給予所述患者本發(fā)明的輪狀 病毒顆粒，例如W本發(fā)明免疫原性組合物的形式給予。
[0021] 通過適應(yīng)本文所述的方法，本發(fā)明的基礎(chǔ)概念可拓展成其它(Ξ聚體或非Ξ聚體） 異源蛋白和其它病毒(尤其是呼腸孤病毒)或組裝形式(例如病毒樣顆粒、鐵蛋白籠等）。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 病毒顆粒
[0024] 輪狀病毒是呼腸病毒科家族中的雙鏈RN病毒的屬，其包括五種已知類型(輪狀病 毒A-E)。輪狀病毒是兒童腸胃炎的主要致病因素。輪狀病毒是無包膜、Ξ層的二十面體顆 粒。感染性的Ξ層的顆粒(TLP)或病毒粒由非感染性的雙層顆粒(DLP)形成，通過用殼蛋白 VP7和纖突蛋白VP4包被化P形成。VP7是Ξ聚體，而260個此類Ξ聚體修飾經(jīng)包被的顆粒的外 偵U。所述化P，其由同屯、VP2和VP6二十面體蛋白質(zhì)層組成，直徑為約700 A，并且W殼體包裹 11種雙鏈RNA基因組區(qū)段，病毒聚合酶(VP1)和加帽酶(VP3)。在感染細(xì)胞的過程中，VP4和 VP7蛋白（其形成所述輪狀病毒顆粒的外層），在低巧環(huán)境(很可能在內(nèi)體隔室中）從DLP解 離-該過程稱為"脫殼"-并且將包含病毒RNA轉(zhuǎn)錄機(jī)器的化P遞送進(jìn)入胞質(zhì)。在那里，DLP合成 帽，并釋放11種mRNA物質(zhì)的拷貝。
[0025] VP4和VP7從輪狀病毒顆粒的解離或"脫殼"可通過使輪狀病毒顆粒在巧馨合劑例 如邸TA或EGTA的存在下解育，或通過熱激來體外進(jìn)行。所得的DLP可用重組表達(dá)的VP4和VP7 體外再包被W形成完全感染性的輪狀病毒顆粒。W此方式再包被的顆粒是非常有序的，并 且可給出高分辨率冷凍圖像和密度圖。采用體外重建的TLP，冷凍已被用于W與X射線 晶體學(xué)相當(dāng)?shù)姆直媛恃芯枯啝畈《窘M裝和脫殼的分子相互作用(參見參考文獻(xiàn)1和2)。
[0026] 發(fā)明人在本文中顯示，異源性Ξ聚體蛋白質(zhì)（例如流感血凝素）能連接至Ξ聚體 VP7蛋白，由此形成能夠從合適地再包被的輪狀病毒化P的表面突出的嵌合表面蛋白，因此 能夠采用相同冷凍EM方法來測定所述異源蛋白的結(jié)構(gòu)，所述冷凍EM方法已于先前提供接近 原子分辨率的輪狀病毒及其亞顆粒的結(jié)構(gòu)。所述方法第一次使開發(fā)用于確定抗原-抗體復(fù) 合物的結(jié)構(gòu)的高通量試驗成為可能。運在先前是不可能的，因為X射線晶體學(xué)(其已是測定 抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的可用方法)的限制條件。
[0027] 原則上，包含內(nèi)層和外層的任何無包膜的二十面體病毒顆粒均可用于實踐本發(fā)明 的方法。例如，采用任何二十面體病毒，展示包含全部或部分異源蛋白的嵌合表面蛋白是簡 易可行的，為此已建立了用于生成病毒顆粒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)?；谫|(zhì)粒的，由十種呼腸孤 病毒cDNA構(gòu)建體組成的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)已被建立用于哺乳動物呼腸孤病毒(參見參考文獻(xiàn) 3)。鐵蛋白籠的八聚體對稱也具有3倍軸對稱，并且適合于實踐本發(fā)明?？山M裝成顆粒狀、常 規(guī)結(jié)構(gòu)的具有Ξ倍軸對稱的其它蛋白質(zhì)可適合于實踐本發(fā)明。
[0028] 理想上，無包膜二十面體病毒的病毒顆粒的外層可被移除或剝?nèi)?，例如通過蛋白 酶處理或在低巧條件下，W產(chǎn)生僅包含內(nèi)層且可用重組產(chǎn)生的外層蛋白再包被的亞病毒顆 粒。通過添加重組表達(dá)的外層蛋白將亞病毒顆粒體外再組裝或再包被成完全病毒顆粒在W 下情況中是特別有利的:所述嵌合表面蛋白的存在會干擾采用反向遺傳學(xué)方法的細(xì)胞培養(yǎng) 物中繁衍的病毒的正確組裝。此外，進(jìn)需要構(gòu)建用于外層蛋白的表達(dá)載體，排除了對適當(dāng)?shù)?高效的基于質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的需要。天然病毒可在組織培養(yǎng)細(xì)胞中簡單繁衍，并且 病毒顆?？杀粍?nèi)ネ鈱?，并用重組表達(dá)的外層蛋白體外再組裝。因此，采用依賴于將亞病毒 顆粒體外再包被成完全病毒顆粒的方法消除了對轉(zhuǎn)染大量的質(zhì)粒的需要，并排除了從基于 質(zhì)粒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生大量的病毒顆粒所通常需要的額外繁衍步驟，運使所述方法更 加適于高通量應(yīng)用。
[0029] 根據(jù)發(fā)明人的理解，病毒顆粒的外層可被剝?nèi)デ襾啿《绢w?？捎弥亟M表達(dá)的外層 蛋白再包被W形成感染性的病毒顆粒的所有已知的無包膜二十面體病毒均屬于呼腸病毒 科家族。該家族被細(xì)分為兩個亞家族，光滑呼腸孤病毒亞科(Sedoreovirinae)和刺突呼腸 孤病毒亞科(Spinareovirinae)，其分別包含六個和九個屬。亞家族光滑呼腸孤病毒亞科包 括卡多呼腸孤病毒(Cardoreovirus)，米莫呼腸孤病毒(Mimoreovirus)、環(huán)狀病毒（環(huán)狀病 毒）、植物呼腸弧病毒（Phytoreovirus)、輪狀病毒（Rotavirus)和東南亞十二節(jié)段RNA病毒 (Seadornavirus)屬。亞家族刺突呼腸孤病毒亞科包括水產(chǎn)呼腸孤病毒(Aquareovirus)、科 羅拉多壁蟲熱病毒（Col ti virus )、質(zhì)型多角體病毒（Cypo virus )、迪諾維納病毒 (Dinovernavirus)、斐濟(jì)病毒(Fi jivirus)、蟲源呼腸孤病毒（Idnoreovirus)、真菌呼腸孤 病毒(Mycoreovirus)、正呼腸孤病毒（(Irthoreovirus)和水稻病毒（Oiyzavirus)屬。
[0030] 除了輪狀病毒W(wǎng)外，哺乳動物正呼腸孤病毒也有利于實踐本發(fā)明。對于運些病毒， 用于外衣殼的完全體外組裝的合適條件和冷凍EM的應(yīng)用均已成熟建立(參見參考文獻(xiàn)1、2、 4和5)。冷凍EM已經(jīng)對其應(yīng)用并且其結(jié)構(gòu)信息已經(jīng)可得的其它正呼腸孤病毒(例如拂拂或禽 類正呼腸孤病毒)水稻病毒(例如水稻皺縮矮化病毒)和水產(chǎn)呼腸孤病毒(參見參考文獻(xiàn)6、7 和8)也可適合于實踐本發(fā)明。
[0031] 質(zhì)型多角體病毒和迪諾維納病毒僅具有等同的內(nèi)衣殼，并因此通常被認(rèn)為不適用 于實踐本發(fā)明，從而被認(rèn)為是較不優(yōu)選的。在某些實施方式中，用于本發(fā)明的無包膜二十面 體病毒不包括質(zhì)型多角體病毒和迪諾維納病毒。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的病毒可 W生物安全水平2或更低水平制造(參見參考文獻(xiàn)9)。
[0032] 優(yōu)選地，用于實踐本發(fā)明的病毒顆粒具有Ξ種或更少的外層蛋白。更優(yōu)選地，所述 病毒顆粒的外層可由單一外層蛋白形成，其為用于制備所述嵌合表面蛋白的外表面蛋白。 小數(shù)量的外層蛋白是有利的，因為需要被重組表達(dá)W再包被剝離后的亞病毒顆粒的蛋白質(zhì) 較少。
[0033] 例如，輪狀病毒具有兩種外層蛋白，VP4和VP7,但形成輪狀病毒顆粒的外層僅需要 VP7是殼蛋白。在大多數(shù)情況中，僅僅采用一種外層蛋白，VP7,來再包被輪狀病毒DLP就足W 實踐本發(fā)明。
[0034] 嵌合表面蛋白
[0035] -方面，本發(fā)明設(shè)及包含共價連接至異源蛋白的輪狀病毒表面蛋白的嵌合表面蛋 白。所述輪狀病毒表面蛋白可通過接頭序列連接至所述異源蛋白。在一個特定實施方式中， 所述異源蛋白被插入所述輪狀病毒表面蛋白的柔性環(huán)，其為外表面暴露部分。在一些情況 中，刪去所述輪狀病毒表面蛋白的部分W更好地配合所述接頭序列和/或異源蛋白。例如， 短N(yùn)末端和C末端截短體（^ 10氨基酸)通常不影響輪狀病毒VP7蛋白再包被輪狀病毒化P的 能力。此外，當(dāng)采用VP7來再包被DLP時，形成從所述病毒顆粒延伸出來的表面環(huán)的氨基酸序 列不是必需的。缺失是否會影響VP7蛋白再包被化P的能力可通過使重組表達(dá)的VP7蛋白在 DLP的存在下解育，并觀察再包被的病毒顆粒的形成來評估。
[0036] 在本發(fā)明的另一個方面中，所述輪狀病毒表面蛋白通過銜接子系統(tǒng)非共價地連接 至所述異源蛋白。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，所述異源蛋白通過兩部分型銜接子系統(tǒng)非共 價地結(jié)合至所述輪狀病毒表面蛋白，其中，所述銜接子系統(tǒng)的一部分連接至所述輪狀病毒 表面蛋白和所述銜接子系統(tǒng)的另一部分連接至所述異源蛋白，其中所述銜接子系統(tǒng)的運兩 部分形成穩(wěn)定的復(fù)合物從而將所述異源蛋白非共價地連接至所述輪狀病毒表面蛋白。所述 銜接子系統(tǒng)通常由第一銜接多膚和第二銜接多膚組成。第一銜接多膚融合至所述輪狀病毒 表面蛋白，任選地通過接頭序列融合。第二銜接多膚融合至所述異源蛋白，任選地通過接頭 序列融合。第一和第二銜接多膚彼此相互作用W形成穩(wěn)定的復(fù)合物，由此將所述輪狀病毒 表面蛋白非共價地連接至所述異源蛋白，從而形成嵌合表面蛋白。
[0037] 病毒表面蛋白
[0038] 適合于實踐本發(fā)明的病毒顆粒的外層通常包含數(shù)種不同外表面蛋白。主要表面蛋 白特別合適于展示異源蛋白，因為它覆蓋病毒顆粒的大部分表面。例如，輪狀病毒的外表面 (排除纖突）由780個拷貝的VP7蛋白形成，其形成同源Ξ聚體。選擇具有形成同源Ξ聚體的 主要表面蛋白的病毒顆粒是用于實踐本發(fā)明所特別優(yōu)選的。
[0039] 在一個特定實施方式中，所述病毒表面蛋白是輪狀病毒表面蛋白。在另一個特定 實施方式中，所述病毒表面蛋白是糖蛋白。
[0040] 具有可適合于實踐本發(fā)明的病毒表面蛋白的其它病毒包括正呼腸孤病毒。例如， 水產(chǎn)呼腸孤病毒的病毒外衣殼由稱為VP5的蛋白質(zhì)的200個Ξ聚體組成。在哺乳動物正呼腸 孤病毒中，感染性的呼腸孤病毒顆粒的外層包含600個拷貝的Ξ聚體膜穿透蛋白μ1，其與蛋 白質(zhì)伴侶〇3(也W600個拷貝形式存在)聯(lián)接，從而形成異六聚體。
[0041] 異源蛋白
[0042] 采用Ξ聚體輪狀病毒表面蛋白可展示許多異源蛋白，前提條件是選擇何時長度的 接頭和/或表面蛋白中的合適插入位點，W避免單體組裝成Ξ聚體過程中發(fā)生位阻現(xiàn)象。對 于所述異源蛋白，沒有尺寸上限，只要所述異源蛋白形成的體積不與相鄰的其它固定的異 源蛋白的體積重疊即可。優(yōu)選地，采用銜接子系統(tǒng)來在Ξ聚體輪狀病毒表面蛋白上展示所 述異源蛋白。不具溶解性、形成高級寡聚體或聚集體的異源蛋白通常被認(rèn)為不適于實踐本 發(fā)明。
[0043] 考慮到位阻現(xiàn)象的任何尺寸約束條件均可通過選擇合適的接頭或銜接子系統(tǒng)來 克服。
[0044] 對于所述異源蛋白，術(shù)語"異源性"通常指，所述蛋白質(zhì)不是輪狀病毒蛋白質(zhì)。在一 些實施方式中，表述"異源蛋白"可W指所述蛋白質(zhì)不源自與展示所述蛋白質(zhì)所用相同的輪 狀病毒毒株。
[0045] Ξ聚體表面蛋白特別合適于展示Ξ聚體異源蛋白。Ξ聚體異源蛋白的示例包括Ξ 聚體病毒細(xì)胞侵入蛋白和其它Ξ聚體病毒表面蛋白，具體是被中和抗體祀向的那些。具體 的示例有，流感血凝素化Α)、人免疫缺陷型病毒化IV)gpl40、埃博拉病毒糖蛋白、狂犬病病 毒糖蛋白（RVG)，山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒的化V蛋白，呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白，人單純 性瘤疹病毒和人巨細(xì)胞病毒化CMV)中發(fā)現(xiàn)的濁蛋白及其復(fù)合物，等。
[0046] 在一些實施方式中，所述輪狀病毒表面蛋白和/或所述異源蛋白包含Ξ聚化標(biāo)簽， W協(xié)助由Ξ聚體輪狀病毒表面蛋白和Ξ聚體異源蛋白形成的異六聚體復(fù)合物的組裝。所述 Ξ聚化標(biāo)簽，尤其是基于卷曲螺旋的Ξ聚化標(biāo)簽(例如GCN4, [10])，也可作為結(jié)構(gòu)模塊W延 伸異源蛋白的可用空間，所述異源蛋白在用經(jīng)修飾的輪狀病毒VP7蛋白再包被的輪狀病毒 顆粒的表面上展示。另一種合適的Ξ聚化標(biāo)簽可源自細(xì)菌隧菌體T4隧菌體次要纖維蛋白 (Fibritin)[ll]。
[0047] 在某些實施方式中，非Ξ聚體形式的異源蛋白可與所述輪狀病毒表面蛋白上存在 的Ξ聚化標(biāo)簽相互作用。舉例來說，如果所述異源蛋白具有能夠與基于卷曲螺旋的Ξ聚化 標(biāo)簽的α螺旋相互作用的可及的α螺旋，則異源蛋白能夠結(jié)合該Ξ聚化標(biāo)簽。若沒有位阻現(xiàn) 象，至多Ξ個所述異源蛋白能夠同時結(jié)合所述Ξ聚化標(biāo)簽，形成六螺旋束狀物。如果結(jié)合了 少于Ξ個所述異源蛋白，則該六螺旋束狀物將會是不完整的，其包含輪狀病毒蛋白質(zhì)上存 在的Ξ聚化標(biāo)簽造成的內(nèi)部Ξ螺旋，但僅包含所述束狀物的一個或兩個外螺旋。所述非Ξ 聚體異源蛋白可具有1、2、4或更多個亞基（即，是單體、二聚體、四聚體或其它寡聚體），前提 條件是所述亞基中至少一個具有能夠與所述輪狀病毒表面蛋白上存在的Ξ聚化標(biāo)簽相互 作用的α螺旋。
[0048] 在某些實施方式中，單體異源蛋白可包括排列的多個α螺旋，從而，多于一個螺旋 能夠與所述輪狀病毒表面蛋白上存在的Ξ聚化標(biāo)簽的α螺旋相互作用，形成完整或局部六 螺旋束狀物。在某些實施方式中，其中至少Ξ個所述單體包含合適排列的α螺旋的四聚體 (或更高級結(jié)構(gòu))可與連接至所述輪狀病毒表面蛋白的Ξ聚化標(biāo)簽聯(lián)合，W形成六螺旋束狀 物。在某些實施方式中，其中至少Ξ個所述單體包含合適排列的α螺旋的四聚體(或更高級 結(jié)構(gòu))可與和所述輪狀病毒表面蛋白相聯(lián)的Ξ聚化標(biāo)簽聯(lián)合，W形成局部六螺旋束狀物，其 缺失所述外螺旋之一。所述異源蛋白的亞基可W是相同的（即，同二聚體、同Ξ聚體、同四聚 體等)或可W是不相同的（即，異二聚體、異Ξ聚體、異四聚體等）。
[0049] 如果所述輪狀病毒表面蛋白上存在的Ξ聚化標(biāo)簽不是α螺旋卷曲螺旋，則所述異 源蛋白上的相互作用性結(jié)構(gòu)元件可具有與Ξ聚化標(biāo)簽而非α螺旋結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)。
[0050] 優(yōu)選地，所述異源蛋白不是特異