地保 留天然表位用于進(jìn)一步體內(nèi)測(cè)試的候選免疫原。
[0157] 免疫原性組合物
[0158] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明設(shè)及包含本發(fā)明的嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒在制備 藥物中的應(yīng)用。具體是，包含本發(fā)明的嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆?？捎糜谶m合于人疫苗 接種的免疫原性組合物中。例如，所述嵌合表面蛋白可被設(shè)計(jì)W展示在給予患者時(shí)引發(fā)保 護(hù)性免疫應(yīng)答的異源蛋白。
[0159] 嵌合病毒用于引發(fā)針對(duì)病原體源性的抗原的免疫應(yīng)答的應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的。常規(guī) 上，該方法需要重新工程改造選擇作為病原體源性的抗原的載體的宿主病毒的基因組。所 述方法具有多種限制。通常，病毒基因組經(jīng)修飾W包含編碼抗原的病原體源性的基因。因 此，所選病毒的基因組大小會(huì)限制可被表達(dá)的病原體源性的抗原的大小。類似地，編碼病原 體源性的抗原的基因的插入會(huì)干擾病毒的繁衍，并限制可獲得的產(chǎn)率。因此，嵌合病毒的制 備需要針對(duì)各病原體源性的抗原進(jìn)行優(yōu)化。
[0160] 采用重組遺傳學(xué)產(chǎn)生具有新表面蛋白的嵌合病毒，W通過(guò)插入病原體源性的抗原 的編碼區(qū)來(lái)改變宿主病毒的基因組，很可能會(huì)改變嵌合病毒的宿主范圍，從而，新生成的病 毒的病原性方面會(huì)有不可預(yù)見(jiàn)的后果。因此已采用額外的步驟來(lái)提供足夠減毒的嵌合病 毒，其無(wú)法在疫苗接種的對(duì)象中復(fù)制。
[0161] 本發(fā)明克服了與傳統(tǒng)方法相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題，因?yàn)槠湓试S制備可用于再包被輪狀病毒 DLP的任何種類的嵌合表面蛋白。所述再包被的輪狀病毒顆粒不包含病原體源性的抗原的 任何遺傳信息。因此，在用所述再包被的輪狀病毒顆粒初始感染宿主細(xì)胞之后，不形成攜帶 所述病原體源性的抗原的子代病毒。
[0162] 兩部分型銜接子系統(tǒng)的應(yīng)用還減少了優(yōu)化步驟的數(shù)量。一旦制備了融合至第一銜 接多膚的經(jīng)修飾的輪狀病毒蛋白質(zhì)，可將任何已知的病原體源性的抗原融合至第二銜接多 膚，其與第一銜接多膚形成穩(wěn)定復(fù)合物。運(yùn)消除了對(duì)于輪轉(zhuǎn)病毒進(jìn)行遺傳工程改造的任何 需要。在大多數(shù)情況中，病原體源性的抗原的表達(dá)和純化不受病原體源性的抗原中存在的 第二銜接多膚的影響，從而不需要對(duì)現(xiàn)有的表達(dá)和純化方法做出任何修改?？刹捎矛F(xiàn)有的 用嵌合表面蛋白再包被輪狀病毒化P的方案來(lái)制備包含嵌合表面蛋白的輪狀病毒顆粒，所 述嵌合表面蛋白包含通過(guò)兩部分型銜接子系統(tǒng)連接至病原體源性的抗原的經(jīng)修飾的輪狀 病毒蛋白質(zhì)。然后，可將運(yùn)些輪狀病毒顆粒納入免疫原性組合物中，W針對(duì)病原體源性的抗 原引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0163] 該疫苗平臺(tái)特別有用于制備免疫原性組合物，其中，所述輪狀病毒顆粒包含Ξ聚 體嵌合表面蛋白，該Ξ聚體嵌合表面蛋白含有異源性Ξ聚體病毒細(xì)胞侵入蛋白。Ξ聚體病 毒細(xì)胞侵入蛋白是許多病毒的免疫顯性的表面抗原。例外的情況有：乙型肝炎表面抗原和 人乳頭狀瘤病毒L1蛋白質(zhì)，上述兩者均形成病毒樣顆粒，W及流感HA，其形成蓮座叢，基于 免疫顯性的病毒表面抗原的亞基疫苗通常無(wú)法獲得臨床有效的疫苗。通過(guò)在輪狀病毒顆粒 上W其天然構(gòu)象展示運(yùn)些病毒表面抗原，可制備針對(duì)病毒引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性 組合物，其中，所述表面抗原最初源自所述病毒。
[0164] Ξ聚體病毒型細(xì)胞侵入蛋白的具體示例包括流感HA、HIV甜140、埃博拉病毒糖蛋 白、狂犬病病毒糖蛋白、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒的Env蛋白、RSV F蛋白、濁和任選的其與人單 純性瘤疹病毒和HCMV的其它蛋白質(zhì)的復(fù)合物。
[0165] 輪狀病毒顆粒
[0166] 輪狀病毒特別有用，因?yàn)榇嬖诰哂写_定的宿主范圍的多種動(dòng)物毒株。例如，一些毒 株特定用于奶牛，而其它毒株用于猴子。大多數(shù)動(dòng)物毒株的抗原性與通常感染人的那些毒 株的抗原性不同，因此大多數(shù)無(wú)法導(dǎo)致人的疾病。因此，當(dāng)運(yùn)些動(dòng)物毒株被用于人疫苗接種 的免疫原性組合物中的載體時(shí)，人對(duì)于能夠干擾針對(duì)嵌合表面蛋白的免疫應(yīng)答的運(yùn)些輪狀 病毒毒株通常不具有任何預(yù)先存在的免疫力。此外，運(yùn)些病毒在人中是天然減毒的。
[0167] 此外，目前市場(chǎng)上有兩種獲批的減毒活輪狀病毒疫苗：Rotarix?和RotaTeq?。 Rotarix?包含減毒的人輪狀病毒毒株RIX4414,其在原代綠猴腎細(xì)胞(AGMK)中傳了 26代，并 在Vero細(xì)胞中繁衍。RotaTeq?包含分別標(biāo)為61、62、63、64和？1的五種人輪狀病毒化3￥)-牛 輪狀病毒(BRV)重配毒株的組合，其也在Vero細(xì)胞中繁衍。所有重配子均由表達(dá)人VP7或VP4 蛋白質(zhì)的BRV毒株WC3 (G6P7 [ 5 ])基因組背景組成。
[0168] 先前獲批的基于恒河猴輪狀病毒(RRV)的疫苗Rota化ield?由RRV(G3P5B[3])和3 種RRV-HRV重配輪狀病毒組成。各重配子從RRV衍生10個(gè)基因，和編碼VP7蛋白的單一HRV基 因，供于G血清型 1、2或4特異性(G1P5B[ 3]，G2P5B[ 3巧PG4P5B[ 3])。
[0169] 此外，已建立單價(jià)牛(NCDV RIT4237G6P6)和猿(RRV毒株MMU18006G3P5B)輪狀病毒 毒株用作疫苗的安全性。
[0170] 采用運(yùn)些疫苗毒株的免疫、臨床安全性和制造經(jīng)驗(yàn)可直接施用于本發(fā)明的輪狀病 毒顆粒。例如，獲批的輪狀病毒疫苗中包含的任何一種輪狀病毒均可被用于制備化P，供于 用本發(fā)明的嵌合表面蛋白的再包被。
[0171] 制備
[0172] 包含在所述免疫原性組合物中的經(jīng)修飾的輪狀病毒顆粒可采用任何上述方法制 備。天然輪狀病毒顆粒可經(jīng)繁衍和純化。然后，可使純化的輪狀病毒顆粒脫殼W制備DLP，其 可隨后用包含病原體源性的抗原的嵌合表面蛋白再包被。
[0173] 通常，將融合至第一銜接多膚的經(jīng)修飾的輪狀病毒蛋白質(zhì)添加至化P，W形成輪狀 病毒顆粒。任選地，進(jìn)一步地添加的輪狀病毒蛋白質(zhì)與所述輪狀病毒表面蛋白一起形成天 然輪狀病毒顆粒的外層。然后，使輪狀病毒顆粒與融合至第二銜接多膚的病原體源性的抗 原解育，所述第二銜接多膚與第一銜接多膚形成穩(wěn)定復(fù)合物，W提供所述嵌合表面蛋白。
[0174] 制劑
[0175] 本發(fā)明的免疫原性組合物可W試劑盒的形式提供，所述試劑盒包含含有凍干的輪 狀病毒顆粒的第一容器，和含有用于臨時(shí)重懸凍干的輪狀病毒顆粒的溶液的第二容器。凍 干的輪狀病毒顆粒可包含一種或多種凍干保護(hù)劑例如薦糖、右旋糖、山梨醇和氨基酸，W使 所述輪狀病毒顆粒在凍干過(guò)程中穩(wěn)定。
[0176] 或者，所述免疫原性組合物可在包含懸液中的輪狀病毒顆粒的單一容器。其中，所 述免疫原性組合物用于注射，其可在注射器中提供。
[0177] 各溶液可包含一種或多種賦形劑。
[0178] 所述溶液通?；谒?。因此，純化的水可形成主要賦形劑。例如，稀釋輪狀病毒顆 粒W獲得所需最終濃度通常將會(huì)采用注射用水(WFI)進(jìn)行。
[0179] 所述溶液通常包含緩沖劑。因此，其它賦形劑包括緩沖劑和抑調(diào)節(jié)劑，例如巧樣酸 鋼、憐酸二氨鋼一水合物，和氨氧化鋼?？商砑涌顾釀├缣妓崆蒞防止病毒在移動(dòng)通過(guò)胃 時(shí)失活(如果免疫原性組合物是口服給予的話）。還可包含酸度調(diào)節(jié)劑例如己二酸二鋼，優(yōu) 選地，替代抗酸劑。
[0180] 在一些情況中，增稠劑例如黃原膠可作為其它賦形劑存在。
[0181] 也可存在表面活性劑，具體是非離子表面活性劑例如聚山梨醇醋80。
[0182] 其它賦形劑包括薦糖、山梨醇、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和維生素。
[0183] 組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg-400m0sm/kg，優(yōu)選為240-360m0sm/kg，更優(yōu)選 為280-320m0sm/kg。
[0184] 本發(fā)明組合物的pH通常為5.0-7.5，更一般為5.0-6.0(最佳穩(wěn)定性）。
[0185] 本發(fā)明組合物優(yōu)選每劑量含有< 1抓（內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)度量，1抓等于0.化g抑A參 比標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 EC-2'RSE'），優(yōu)選每劑量<0.1抓。
[0186] 本發(fā)明組合物優(yōu)選地不含谷蛋白。此外，本發(fā)明的組合物優(yōu)選無(wú)菌組合物。
[0187] 給藥
[0188] 所述免疫原性組合物可用于刺激粘膜免疫應(yīng)答。因此，可經(jīng)口服或氣管內(nèi)遞送所 述免疫原性組合物?？蛇x擇給予的其它途徑，例如肌內(nèi)注射，運(yùn)取決于包含在本發(fā)明免疫原 性組合物中的經(jīng)修飾的輪狀病毒顆粒的表面上展示的病原體源性的抗原。
[0189] 概述
[0190] 術(shù)語(yǔ)"包括"涵蓋"包含"W及"由……組成"，例如，"包括"X的組合物可W僅由X組 成或可W包括其它物質(zhì)，例如X+Y。
[0191 ]詞語(yǔ)"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能完全不含Y。需要時(shí)， 詞語(yǔ)"基本上"可從本發(fā)明的定義中略去。
[01W]術(shù)語(yǔ)"約"相關(guān)于數(shù)值X，表示，例如，x± 10%或X+所述值的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。在某些 實(shí)施方式中，"約"被理解為特定技術(shù)領(lǐng)域中的可接受的變化量和公差。除非上下文中清楚 地說(shuō)明，本文中的所有數(shù)學(xué)術(shù)語(yǔ)均應(yīng)理解為被"約"修飾。術(shù)語(yǔ)"抗體"包括抗體片段，例如抗 原-結(jié)合片段(Fab)、單鏈可變片段(scFv)等。抗體(或"抗體部分"）的術(shù)語(yǔ)"抗原-結(jié)合部分" 包括保留特異性結(jié)合抗原的能力的抗體的片段。已證明，抗體的抗原結(jié)合功能可由全長(zhǎng)抗 體的片段行使。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"所涵蓋的結(jié)合片段的示例包括：（i)化b片段，由 化、Vh、Cl和扣1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；（ii)F(ab'）2片段，包含在較鏈區(qū)由二硫橋連接的兩 個(gè)化b片段的二價(jià)片段；（iii)Vh和姑1組成的Fd; (iv)由抗體單臂化和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片 段；（V)由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段[63];和(Vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)。而且，盡管Fv片段 的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，化和Vh，分別由不同基因編碼，但可通過(guò)重組方法，利用合成接頭使其連接成 為一條蛋白鏈，其中化和Vh區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見(jiàn)例如，參考文獻(xiàn)64 和65。。此類單鏈抗體也應(yīng)該為術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"所涵蓋。
[0193] 除非上下文中有明確的說(shuō)明，本文中所用的"或"理解為包含且能與"和/或"互換 使用。
[0194] 除非上下文中有明確說(shuō)明，"一個(gè)/種"和"所述"理解為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)的情況。 [01M]除非另有明確說(shuō)明，包括混合兩種或更多種組分的步驟的工藝不要求任何特定的 混合順序。因此，組分可W任何順序混合。在有Ξ種組分時(shí)，可將兩種組分相互合并，然后可 將組合與第Ξ種組分合并等。
[0196] 將動(dòng)物(特別是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞W制備用于給予動(dòng)物(尤其是人類）的材料 時(shí)，其應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，具體是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來(lái)源。總體而 言，當(dāng)制備給予動(dòng)物(尤其是人）的產(chǎn)品時(shí)，優(yōu)選在完全不含動(dòng)物源性的物質(zhì)的情況下培養(yǎng) 細(xì)胞。
[0197] 當(dāng)細(xì)胞底物用于重組或反向遺傳學(xué)方法時(shí)，優(yōu)選批準(zhǔn)用于人類疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞底 物，例如化Eur (《歐洲藥典》)總綱5.2.禮66 ]所述的細(xì)胞底物。
[0198] 優(yōu)選通過(guò)MPSRCH程序（牛津分子科技公司（Oxford Molecular))中設(shè)置的Smith-Waterman同源性捜索算法，利用仿射缺口捜索測(cè)定多膚序列之間的相同性，其中參數(shù)為缺 口開(kāi)放罰分= 12、缺口延伸罰分=1。
【附圖說(shuō)明】
[0199] 圖1:對(duì)(A)輪狀病毒VP7蛋白和(B)所述異源蛋白進(jìn)行的修飾的示意圖。皿1和皿2 形成兩部分型銜接子系統(tǒng)的部分，所述兩部分型銜接子系統(tǒng)用于將所述異源蛋白非共價(jià)地 結(jié)合至輪狀病毒VP7蛋白。所述異源性信號(hào)膚序列所起的作用是實(shí)現(xiàn)所選表達(dá)系統(tǒng)中的高 表達(dá)水平。親和標(biāo)簽使純化簡(jiǎn)易。蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)Pi可用于在純化之后移除親和標(biāo)簽Ai。第 二組親和和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(A2和P2)可被合適的接頭序列替代，并且可W起到間隔子序列 的作用，運(yùn)可能是展示較大異源蛋白所需的。Ξ聚化標(biāo)簽是任選的，并且可用于協(xié)助一些異 源蛋白的Ξ聚體形成，運(yùn)隨后促進(jìn)對(duì)于Ξ聚體輪狀病毒VP7蛋白的結(jié)合。所述Ξ聚化標(biāo)簽， 尤其是基于卷曲螺旋的Ξ聚化標(biāo)簽(例如GCM)，也可作為結(jié)構(gòu)模塊W延伸異源蛋白的可用 空間，所述異源蛋白在用經(jīng)修飾的輪狀病毒VP7蛋白再包被的輪狀病毒顆粒的表面上展示。
[0200] 圖2:由經(jīng)修飾的Ξ聚體輪狀病毒VP7蛋白和Ξ聚體異源蛋白形成的復(fù)合物的示意 圖。輪狀病毒VP7蛋白通過(guò)兩部分型銜接子系統(tǒng)非共價(jià)地結(jié)合至所述異源蛋白，其中，所述 銜接子系統(tǒng)的一部分化R2)連接至所述輪狀病毒VP7蛋白，而所述銜接子系統(tǒng)的另一部分 化R1)連接至所述異源蛋白。皿1和皿2形成六螺旋束狀物，導(dǎo)致用于將所述異源蛋白非共價(jià) 地連接至輪狀病毒VP7蛋白的穩(wěn)定復(fù)合物。所述嵌合表面蛋白可通過(guò)對(duì)其體外再包被化Ρ而 成為所述輪狀病毒顆粒的外層。
[0201] 圖3:電子顯微鏡照片：（Α)純化的DLP、(B)用輪狀病毒VP7蛋白再包被的DLP，和(C) 用展示作為異源蛋白的流感病毒HA的VP7蛋白再包被的DLP。在拍照之前，對(duì)顆粒負(fù)染。
[0202] 圖4:(A)SDS-PAGE之后考馬斯染色的丙締酷胺凝膠。泳道1顯示分子量標(biāo)志物 (MW)。泳道2采用用于再包被反應(yīng)化LP)的純化的DLP上樣。泳道3采用用于再包被DLP的純化 的VP7-HA蛋白質(zhì)復(fù)合物(pro)上樣。泳道4采用用于再包被反應(yīng)的化P、經(jīng)修飾的VP7蛋白和 HA蛋白質(zhì)的輸入混合物（inp)上樣。泳道5-7采用CsCl梯度上的再包被的顆粒的純化之后觀 察到的條帶(條帶1和2和上方條帶)上樣。泳道8-14W泳道1-7的相同順序，采用相同樣品上 樣，但在SDS-PAGE之前不向樣品添加還原劑。（B)輪狀病毒化P用CsCl梯度上的VP7-HA蛋白 質(zhì)復(fù)合物再包被。條帶1和2和W及上方條帶對(duì)應(yīng)于圖A中于泳道5-7中上樣的樣品。其中再 包被的顆粒和DLP的位置通常會(huì)按照虛線箭頭指示的那樣遷移.
[0203] 圖5:用(A)展示HA、（B)展示帶有結(jié)合的抗體CR6261的ScFv片段的HA，和(C)展示帶 有結(jié)合的抗體CR6261的化b片段的HA的，經(jīng)修飾的VP7蛋白再包被的輪狀病毒化P的Ξ維重 建截面圖。CR6261識(shí)別接近膜的HA1/HA2莖中的高度保守的螺旋區(qū)。所述重建基于對(duì)再包被 的DLP進(jìn)行的冷凍EM所獲取的圖像。
[0204] 圖6:化P(白）在用經(jīng)修飾的輪狀病毒VP7蛋白和流感病毒HA作為經(jīng)修飾的異源蛋 白再包被的DLP的Ξ維重建上的疊力日。所述重建基于對(duì)再包被的DLP進(jìn)行的冷凍EM所獲取的 圖像。
[0205] 圖7:展示結(jié)合至抗體CR6261的化b片段的流感病毒HA的輪狀病毒顆粒的Ξ維重建 的細(xì)節(jié)。所述輪狀病毒顆粒通過(guò)用包含銜接子序列化R2)的經(jīng)修飾的VP7蛋白再包被化P來(lái) 制備。HA蛋白質(zhì)通過(guò)C末端融合HR1屯膚重復(fù)序列非共價(jià)結(jié)合至經(jīng)修飾的VP7蛋白，其與VP7 蛋白的HR2屯膚重復(fù)序列形成六螺旋束狀物。CR6261在各HA亞基化A1和HA2)的近膜端結(jié)合。 所述重建基于對(duì)再包被的DLP進(jìn)行的冷凍EM所獲取的圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0206] 實(shí)施例1:用于經(jīng)修飾的重組VP7、HA和HIV甜140蛋白質(zhì)的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0207] 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，將恒河猴輪狀病毒（RRV)G3毒株的野生型VP7基因克隆進(jìn)入 pFastBacDual載體（Invitrogen?)的BamH I和Not I限制性位點(diǎn)之間。在VP7編碼序列的起 始密碼子之前的5'端設(shè)計(jì)Kozak序列(GCCACC;SEQ ID N0:19)dVP7編碼序列的修飾通過(guò)反 向PCR進(jìn)行。設(shè)計(jì)合適的退火溫度的引物，其在所述引物的末端處包含相關(guān)修飾。圖1A顯示 向輪狀病毒編碼序列添加的各種修飾。
[0208] 由經(jīng)修飾的VP7編碼序列編碼的最終蛋白質(zhì)具有如下特征：前21個(gè)氨基酸編碼蜜 蜂蜂毒膚信號(hào)序列，供于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)。已移除VP7蛋白信號(hào)膚?？砂?需使用其它信號(hào)序列，例如，人組織纖溶酶原激活物化巧A)的HIV共有信號(hào)序列或信號(hào)膚， 供于在人細(xì)胞中表達(dá)。（b)氨基酸殘基22至33形成任選的親和標(biāo)簽(Strep標(biāo)簽II加接頭，用 于更高效的信號(hào)膚切割），供于蛋白質(zhì)純化目的，并且可被任何其它親和標(biāo)簽，例如His標(biāo) 簽、HA標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽等替代。（C)氨基酸殘基34至40,形成TEV蛋白酶識(shí)別序列，用于切割親 和標(biāo)簽，并且可被任何其它蛋白酶的識(shí)別序列替代，例如PreScission?蛋白酶（即鼻病毒3C 蛋白酶）、因子X(jué)a、腸激酶、凝血酶、弗林蛋白酶等。（d)氨基酸殘基41至136是恒河猴輪狀病 毒VP7N末端部分的序列(VP7氨基酸殘基51至146)。（e)氨基酸殘基137是單氨基酸接頭，并 且可被另一種合適的接頭序列替代。（f)氨基酸殘基138至165是HIV即41HXB2毒株的C-屯 膚重復(fù)部分，并且可被來(lái)自另一種逆轉(zhuǎn)錄病毒、副粘病毒等的屯膚重復(fù)序列替代，只要替代 序列與經(jīng)修飾的HA或甜140蛋白質(zhì)構(gòu)建體中所用的屯膚重復(fù)序列相容即可(參見(jiàn)下文）。（邑） 氨基酸殘基166至187是因子X(jué)a蛋白酶識(shí)別序列，其之后是側(cè)接接頭的蛋白質(zhì)C標(biāo)簽;該修飾 是任選的，并且可被其它序列替代，例如，所謂表位或簡(jiǎn)單接頭序列例如GGSGGSGGSGGSGGS (569 10^:20)或66566566566566566(569 10顯：21)。表位的存在可有利于包裝識(shí)別所 述表位的抗體片段，W進(jìn)一步使用于結(jié)構(gòu)研究目的的展示的組裝子(包括所述異源蛋白）穩(wěn) 定化。如先前所述，結(jié)構(gòu)研究的設(shè)計(jì)是一個(gè)比現(xiàn)存抗原的設(shè)計(jì)更加復(fù)雜的過(guò)程?；?氨基酸 殘基188至367是恒河猴輪狀病毒VP7的C末端部分(VP7氨基酸殘基147至326)。由該經(jīng)修飾 的編碼序列編碼的經(jīng)修飾的VP7蛋白具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
[0209] 制備替代性的構(gòu)建體，其包含前述段落中所述的修飾中的一些。例如，運(yùn)些構(gòu)建體 中的一些包括額外的表位標(biāo)簽，其被抗HIV抗體2F5識(shí)別（例如SEQ ID NO: 29和31)。在其它 構(gòu)建體中，HIV即41HXB2毒株的C-屯膚重復(fù)被尼帕病毒的C-屯膚重復(fù)替代（例如SEQ ID N0:32-41)。屯膚重復(fù)序列的長(zhǎng)度在一些構(gòu)建體(例如SEQ ID N0:27和28)中不同。類似地， 在一些構(gòu)建體中縮短了連接C-屯膚重復(fù)序列和VP7蛋白編碼序列的剩余部分的接頭(參見(jiàn) 例如，SEQ ID N0:24-26)。不同的變體示于表1dSEQ ID N0:22的經(jīng)修飾的VP7蛋白序列作為 參照序列納入。從N末端至C末端顯示表1中的序列。
[0210] 表1
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215] 由載體和經(jīng)修飾的基因組成的DNA通過(guò)PCR生成。PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠純化，并經(jīng)歷Τ4 多聚核巧酸激酶處理W產(chǎn)生憐酸化端。然后對(duì)所得的DM進(jìn)行純端連接，通過(guò)室溫下將DNA 與合適的量的T4連接酶解育2小時(shí)或解育過(guò)夜來(lái)進(jìn)行。然后，連接產(chǎn)物用化η I在37°C處理 30分鐘，然后用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案轉(zhuǎn)化D冊(cè)α細(xì)胞。
[0216] 通常，挑取Ξ至四個(gè)集落，并使細(xì)胞培養(yǎng)物過(guò)夜生長(zhǎng)W采用Miniprep試劑盒 (Qiagen?)制備質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)正確序列。具 有正確序列的質(zhì)粒用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)操作轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞。挑選兩至Ξ個(gè)白色集落用 于各構(gòu)建體，使細(xì)胞培養(yǎng)物過(guò)夜生長(zhǎng)用于通過(guò)異丙醇/乙醇沉淀提取重組桿粒DNA(溶液I: 15mM Tris，pH S.OaOmM EDTA和lOOyg/mL RNA酶A;溶液11:0.21 NaOH和1%SDA;W及溶液 II1: 3M乙酸鐘，pH 5.5;全部無(wú)菌過(guò)濾）。純化的桿粒采用M13引物通過(guò)PCR檢測(cè)，并且，正確 的DNA被用于轉(zhuǎn)染6孔板中的單層sf9細(xì)胞，各空接種有1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后5天收獲P1病 毒，并通過(guò)用0.05~0.1 %P1病毒感染sf9細(xì)胞(密度為1.5~2百萬(wàn)/mL)來(lái)產(chǎn)生P2病毒。感染 后5~7天收獲P2病毒并用于蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0217] 如上所述的經(jīng)修飾的VP7蛋白構(gòu)建體可用于展示形成Ξ聚體的異源蛋白和對(duì)應(yīng)的 經(jīng)修飾的形成Ξ聚體的異源蛋白（參見(jiàn)圖1B，合適的修飾的示意圖）。如圖2所示，經(jīng)修飾的 VP7蛋白的皿2屯膚重復(fù)序列和對(duì)應(yīng)的經(jīng)修飾的形成Ξ聚體的異源蛋白的皿1屯膚重復(fù)序列 通過(guò)六螺旋束狀物形成穩(wěn)定的復(fù)合物，其表面作為銜接子供于將所述異源蛋白非共價(jià)地固 定在輪狀病毒VP7蛋白上。選擇甲型流感血凝素化A)蛋白質(zhì)和HIV-1的gpl40融合蛋白作為 用于形成Ξ聚體的異源蛋白的示例。
[0218] 通過(guò)連接非依賴性克隆化1C)方法將甲型流感病毒Η1Ν1(所羅口群島2006)的ΗΑ基 因克隆進(jìn)入Ρ化stBac LIC?載體化ife Technologies?) npFastBac LIC?載體通過(guò)將LIC位 點(diǎn)插入pFastBacl載體（Invitrogen)來(lái)生成。在所述編碼序列之前的起始密碼子的5'端設(shè) 計(jì)Kozak序列（SEQ ID NO: 19) dHA基因的編碼序列的修飾通過(guò)反向PCR引入。
[0219] 由經(jīng)修飾的HA編碼序列編碼的最終蛋白質(zhì)具有如下特征：（a)前38個(gè)氨基酸編碼 桿狀病毒gp64信號(hào)膚，供于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)。已移除HA蛋白信號(hào)膚?？砂?需使用其它信號(hào)序列，例如，tPA的HIV共有信號(hào)序列或信號(hào)膚，供于在人細(xì)胞中表達(dá)。（b)氨 基酸殘基42至47形成任選的親和標(biāo)簽化is標(biāo)簽加接頭，用于更高效的信號(hào)膚切割），供于蛋 白質(zhì)純化目的，并且可被任何其它親和標(biāo)簽，例如str邱標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽等替代。（C) 氨基酸殘基48至54形成TEV蛋白酶識(shí)別序列，供于切割親和標(biāo)簽。還納入接頭序列。TEV蛋白 酶識(shí)別序列可被任何其它蛋白酶的識(shí)別序列替代，例如PreScission?蛋白酶(即，鼻