Her-2基因和/或top2a基因檢測探針及其制備方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物技術(shù)，特別是涉及HER_2(ERBB2)基因和/或T0P2A基因檢測探針及 其制備方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] HER_2(ERBB2)基因在20%-30%的乳腺癌患者中有基因的擴(kuò)增和蛋白的過度表 達(dá)。HER-2是目前公認(rèn)的一個乳腺癌重要的預(yù)后/預(yù)測因子，在多變量分析結(jié)果中，HER-2是 腫瘤復(fù)發(fā)和總生存期長短的獨(dú)立預(yù)后因素。HER-2陽性的乳腺癌浸潤性強(qiáng)，無病生存期短， 預(yù)后差。曲妥珠單抗(赫賽汀)適用于HER-2過度表達(dá)和基因擴(kuò)增的的乳腺癌。T0P2A基因調(diào) 節(jié)控制DNA的超螺旋狀態(tài)，直接參與細(xì)胞過程，并且是蒽環(huán)類抗生素的靶酶，存在T0P2A基因 異常的患者預(yù)后差，無復(fù)發(fā)生存期縮短，尤其是T0P2A基因缺失的患者預(yù)后更差。基因擴(kuò)增 提示腫瘤有復(fù)發(fā)的可能，或者遠(yuǎn)期的療效下降。T0P2A基因狀態(tài)在預(yù)示腫瘤化療的反應(yīng)情況 和藥物治療效果中都具有一定意義。
[0003] 因此正確檢測和評定乳腺癌HER-2基因和T0P2A基因狀態(tài)至關(guān)重要。
[0004] HER-2基因定位于17號染色體17ql2區(qū)域，HER-2的異常為擴(kuò)增;T0P2A基因定位于 17號染色體17q21區(qū)域，T0P2A的異常情況分為擴(kuò)增和缺失兩種情況，F(xiàn)ISH檢測可對于這兩 種情況作出明確判斷。
[0005] 焚光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是20世紀(jì)80年代末 期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這 項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、 人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知的標(biāo) 記核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可 被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以 探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位 雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因 此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。
[0006] 雜交所用的探針大致可以分類三類：1)染色體特異重復(fù)序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi) 星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號強(qiáng)， 易于檢測；2)全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上 極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得;3) 特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。
[0007]探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記 DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測，同時還可以利用親和 素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp左右的片段。而直接 標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針 時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測時步驟簡單，臨床使用方便。
[0008] 而目前對于HER-2基因和/或T0P2A基因 FISH檢測，還缺少特異性高的檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的之一是提供一種HER-2基因和/或T0P2A基因檢測探針及其制備方 法，所制備的探針可用于檢測HER-2基因和T0P2A基因狀態(tài)，即檢測HER-2基因和T0P2A基因 的指拷貝數(shù)變化，具有很好的特異性。
[0010]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0011] 一種HER-2基因和/或T0P2A基因檢測探針的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)選取針對 HER-2 基因的 BAC 克隆為 RP11-1021P11、RP11-62N23、RP11-1044P23 中 至少一種，或選取BAC克隆為1^11-9812、1^11-10651^2、〇1)-2327115中的至少一種；和/或 選取針對T0P2A基因的BAC克隆為1^11-1152六10、〇1)-321705中至少一種，或選取84(：克隆為 1^11-73706、01)-3087022、1^11-48010、01)-21341(5中的至少一種 ；
[0013] (2)對克隆分別提取質(zhì)粒，得到質(zhì)粒DNA，定量；
[0014] (3)用熒光素標(biāo)記質(zhì)粒DNA，針對同一種基因的質(zhì)粒DNA所標(biāo)記的熒光素相同，針對 HER-2基因和針對T0P2A基因的檢測探針標(biāo)記的熒光素的顏色不相同，即得。
[0015] 在其中一個實(shí)施例中，針對T0P2A基因的所述BAC克隆為RP11-1152A10和CTD-3217C5〇
[0016] 在其中一個實(shí)施例中，針對T0P2A基因的所述BAC克隆為1^1 1-73706、(^0-3087022、RP11-48010、和CTD-2134K5。
[0017] 在其中一個實(shí)施例中，針對HER-2基因的BAC克隆為RP11-1021P11、RP11-62N23和 RP11-1044P23。
[0018] 在其中一個實(shí)施例中，針對T0P2A基因的所述BAC克隆為RP11-98J2、RP11-1065L22 和CTD-2327I15。
[0019] 在其中一個實(shí)施例中，標(biāo)記熒光素選擇本領(lǐng)域已知的熒光染料，優(yōu)選地，熒光素為 .Alexa Flu〇r?48.8、FlTC、Alexa F:lu.or?555.、Rh〇damine、Texas Red、pacific:blue?、. DEACo
[0020] 在其中一個實(shí)施例中，基因探針的標(biāo)記可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的方法將相應(yīng)熒光素 標(biāo)記至雙鏈核酸上，所述方法包括但不限于：隨機(jī)引物法、切口平移等，標(biāo)記基因探針可以 使用市售的缺口平移標(biāo)記試劑盒和/或隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，優(yōu)選abbott和/或Roche公司 的Nick Translation Kit。本發(fā)明步驟(3)優(yōu)選采用隨機(jī)引物法、切口平移法對質(zhì)粒DNA進(jìn) 行熒光素標(biāo)記。
[0021 ] 在其中一個實(shí)施例中，所述標(biāo)記的溫度為24°c-26°c，標(biāo)記的時間為4-6小時。
[0022] 本發(fā)明的另一目的是提供一種HER-2基因和T0P2A基因檢測試劑盒。
[0023]實(shí)現(xiàn)該目的技術(shù)方案如下。
[0024] 一種HER-2基因和/或T0P2A基因檢測試劑盒，包括有上述HER-2基因和/或T0P2A基 因檢測探針。
[0025]在其中一個實(shí)施例中，包括有用于內(nèi)控的17號染色體鑒別探針(CSP17)探針，該鑒 別探針與HER-2基因和T0P2A基因檢測探針標(biāo)記的熒光素的顏色不相同。
[0026] 在其中一個實(shí)施例中，還包括有用于封閉重復(fù)序列的COT Human DNA，和DAPI復(fù)染 劑。
[0027]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0028] 1.本發(fā)明通過篩選到最優(yōu)的HER-2基因和/或T0P2A基因檢測探針及其組合，采用 FISH(Fluorescence In-Situ Hybridization)方法對HER-2基因和T0P2A基因拷貝數(shù)檢測， [0029] 2.本發(fā)明優(yōu)選克隆檢測特異性好，靈敏度高。并通過調(diào)整標(biāo)記時間和溫度，限制長 度探針為500bp左右，提高雜交效率和降低雜交背景。
[0030] 3.信號計數(shù)行準(zhǔn)確、快速，且結(jié)果的重復(fù)性好;通過對HER-2、T0P2A拷貝數(shù)和17號 染色體同時檢測和評估，有利于確定治療方案，篩選更多受益于靶向藥物的乳腺癌患者，提 高患者生存率和總生存期。
[0031 ] 4.通過本發(fā)明所述的HER-2基因和T0P2A試劑盒，從基因水平了解HER-2基因和 T0P2A狀態(tài)改變，多種信號類型表現(xiàn)出實(shí)體組織的腫瘤細(xì)胞遺傳多樣性，可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤生 物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，有助綜合評價各分子標(biāo)志物，輔助乳腺癌預(yù)后判斷及臨床 靶向治療用藥及治療方案選擇。
【附圖說明】
[0032]圖1A為是實(shí)施例1中HER-2基因檢測探針序列的示意圖。
[0033]圖1B為是實(shí)施例1中T0P2A基因檢測探針序列的不意圖。
[0034]圖2為實(shí)施例1中人外周血培養(yǎng)細(xì)胞片HER-2基因和T0P2A基因檢測探針FISH檢測 結(jié)果圖。
[0035]圖3為實(shí)施例4中乳腺癌組織樣本FISH檢測結(jié)果圖，其中，檢測信號類型為2R2G2A， HER-2基因未發(fā)生擴(kuò)增，T0P2A基因未發(fā)生擴(kuò)增。
[0036] 圖4為實(shí)施例4中乳腺癌組織樣本FISH檢測結(jié)果圖，其中，檢測信號類型為成簇R成 簇G2A，HER-2基因和T0P2A基因發(fā)生共擴(kuò)增。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不 同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對本 發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。
[0038]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售 產(chǎn)品。
[0039]除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí) 施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語"和/或"包括一個或多個相關(guān)的所列 項目的任意的和所有的組合。
[0040] 實(shí)施