例1HER-2基因和T0P2A基因檢測探針的制備
[0041 ] 一種HER-2檢測探針(GSPHER-2)的制備方法，包括以下步驟：
[0042]克隆篩選:挑選包含目的基因 HER-2及兩端序列的克隆，如圖1A所示。
[0043] GSPHER-2包括兩組，以下分兩組檢測探針分別制備。
[0044] HER-2 chrl7:37,856,254-37，884,915,28,662bp
[0045]
[0046] 所述T0P2A檢測探針(GSP T0P2A)的制備方法，包括以下步驟：
[0047] 克隆篩選:挑選包含目的基因 T0P2A及兩端序列的克隆，如圖1B所示。
[0048] GSP T0P2A包括兩組，具體如下表，其購買于Invitrogen RP11 BAC及CTD BAC克隆 庫。以下分兩組檢測探針分別制備。
[0049] T0P2A chrl7:38,544,773-38，574,202,29,430bp
[0052] (2)GSP HER-2和GSP T0P2A基因檢測探針制備：使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照說明書要求的操作方法對不同BAC克隆分別進(jìn)行超低拷貝質(zhì)粒DNA提取，通過測定 260nm和280nm處的吸光度對質(zhì)粒DNA定量;采用高壓滅菌的超純水稀釋為200ng/ul，采用 1.5ml的離心管分裝，最后將得到的對應(yīng)HER-2基因或T0P2A基因的2種或3種或4種相應(yīng)組合 的質(zhì)粒DNA混合，-20°C密封保存。
[0053] (3)通過切口平移方法對質(zhì)粒DNA混合物進(jìn)行熒光標(biāo)記，針對GSPHER-2基因的每種 探針標(biāo)記的焚光素為Spectrum-Orange，針對GSP T0P2A基因每種探針標(biāo)記的焚光素為 Spectrum-Green。采用abbott的NickTranslationKit，按如下方案，嚴(yán)格避光條件下在冰上 配制PCR反應(yīng)體系。
[0056] 配完后震蕩混勻，在25°C標(biāo)記5小時，再80°C孵育10分鐘滅活酶。取5ul使用2%瓊 脂糖凝膠做電泳，分別在500bp左右存在彌散的條帶。
[0057]對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀和濃縮，按如下方案在1.5ml離心管中依次加入醋酸鈉 和無水乙醇，避光、冰上配制：
[0058] 標(biāo)記產(chǎn)物 45ul
[0059] 醋酸鈉（Snol/L) 5ul
[0060] 無水乙醇 125ul
[0061] 混勻后置于_70°C冰箱中至少2小時，4°C13000rpm離心30分鐘，小心去上清，勿攪 動沉淀，加入lml的70%乙醇，4°C13000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，小心去上清，勿攪動沉淀，避光 干燥。使用1 u 1純化水溶解沉淀，獲得GSP T0P2A基因探針，避光、-20°C儲存。
[0062] 4.GSP HER-2和GSP T0P2A基因探針驗證：分別使用HER-2探針組1+T0P2A探針組1 制備的雜交液，HER-2探針組2+T0P2A探針組2制備的雜交液為待檢測試劑，使用人類正常分 裂中期淋巴細(xì)胞滴片進(jìn)行探針驗證(檢測方法參考實施例3)。培養(yǎng)細(xì)胞包含中期或間期染 色體DNA，熒光原位雜交時，染色體DNA表現(xiàn)為形態(tài)上可識別的染色體或是細(xì)胞核。如圖2 (應(yīng) 用于HER-2探針組1+T0P2A探針組1的實驗結(jié)果)所示：中期染色體的FISH雜交結(jié)果圖。圖中 可見紅色信號示GSP HER-2,綠色信號示GSPT0P2A，青色信號示CSP 17(用于定位17號染色 體著絲粒探針，購于D17Z1 SpectrumAqua Probe,貨號：06J38-017)。圖中可見HER-2/ T0P2A/17號染色體探針信號明亮，人外周血培養(yǎng)細(xì)胞片中在中期染色體上可觀察到靈敏 度、特異性100%;使用石蠟樣本片進(jìn)行雜交檢測，可以清楚的記錄三個靶標(biāo)拷貝數(shù)。其它相 應(yīng)的探針驗證實驗結(jié)果與HER-2探針組1+TOP2A探針組2的實驗結(jié)果相同，圖省略。
[0063] 實施例2:HER_2基因和T0P2A基因檢測試劑盒制備方法
[0064] HER-2基因和T0P2A基因檢測試劑盒包括有HER-2/T0P2A雜交液和DAPI復(fù)染劑兩個 組分，其中HER-2和T0P2A雜交液包含實施例1所述的一組GSP T0P2A基因探針和一組 GSPHER-2基因探針的組合。HER-2和T0P2A基因分別有兩組檢測探針，兩種基因的兩組可以 隨意組合，本實施例中，所述HER-2基因和T0P2A基因檢測試劑盒為四種，分別為:HER-2 (組 1) +T0P2A (組 1)的組合、HER-2 (組2) +T0P2A (組2)的組合、HER-2 (組 1) +T0P2A (組2)的組合、 HER-2(組2)+T0P2A(組1)的組合，CSP17探針（17號染色體鑒定探針，購于D17Z1 SpectrumAqua Probe，貨號：06J38_017)、用于雜交環(huán)境(促進(jìn)雜交）的緩沖液組分、封閉重 復(fù)序列的COT Human DNA等hDAPI復(fù)染劑主要用于雜交后的細(xì)胞復(fù)染，其中的DAPI會與DNA 結(jié)合，使得細(xì)胞核顯示出藍(lán)色熒光，含有對苯二胺的復(fù)染劑可以保持熒光的穩(wěn)定。
[0065] 具體配方如下：
[0066] (1)雜交液配制
[0067] (2)DAPI復(fù)染劑配制
[0068] 10mg的對苯二胺溶于lml的PBS中，調(diào)節(jié)pH為9 · 0，加入9ml甘油，反復(fù)震蕩混勻，-20 °C儲存。取2.5μ1的DAPI溶液(0. lmg/ml)溶于lml抗褪色液中，避光條件下反復(fù)震蕩混勻，-20°C避光密閉保存。
[0069] (3)成品組裝
[0071] 實施例3:HER-2基因和T0P2A基因檢測試劑盒的檢測方法
[0072] 1、玻片預(yù)處理
[0073] 1.1玻片放入65±5°C恒溫箱中烤片過夜；
[0074] 1.2取出玻片，將其放入二甲苯中室溫脫蠟15分鐘；
[0075] 1.3取出玻片，再將其放入另一缸二甲苯中室溫繼續(xù)脫蠟15分鐘；
[0076] 1.4取出玻片，再將其放入無水乙醇中室溫10分鐘，去除殘留二甲苯；
[0077] 1.5取出玻片，再將其放入100%、90%、70%梯度乙醇室溫復(fù)水各3分鐘；
[0078] 1.6取出玻片，再將其放入純化水中室溫洗滌3分鐘，用無絨紙巾吸取多余水分；
[0079] 1.7取出玻片，再將其放入純化水中100±5°C煮片25分鐘（切片水平放置于容器 中，樣本面朝上）；
[0080] 1.8取出玻片，室溫晾干；
[0081 ] 1.9將玻片正面朝上放在架子上，在樣本區(qū)域滴加適量的胃蛋白酶反應(yīng)液，消化5 ~15分鐘；
[0082] 1.10將多余液體甩去，將其放入室溫2 X SSC中5分鐘；
[0083] 1.11取出玻片，再將其放入另一缸室溫2 X SSC中5分鐘；
[0084] 1.12取出玻片，再將其依次放入室溫70%，90%，100%梯度乙醇脫水各3分鐘；
[0085] 1.13取出玻片，室溫晾干。
[0086] 胃蛋白酶的反應(yīng)時間需要通過預(yù)試驗進(jìn)行確定?？梢允褂猛苽涞臉颖酒此?述方法進(jìn)行預(yù)試驗，通常以5分鐘為間隔時間。例如，分別測試消化時間為5分鐘、10分鐘和 15分鐘，完成"玻片預(yù)處理"后，可以在明場下，使用10X或20X物鏡觀察組織消化狀態(tài);或 者直接進(jìn)行DAP I復(fù)染，進(jìn)行消化狀態(tài)判斷。
[0087] 2、樣品和探針同時變性(避光操作）
[0088] 2.1 2.1從-20 ±5°C冰箱中取出實施例2所述檢測試劑盒中的雜交液，震蕩混勻， 瞬時離心；
[0089] 2.2 2.2加10μ1的雜交液到雜交區(qū)域，迅速蓋上18X18mm蓋玻片，輕壓使雜交液均 勾分布，避免產(chǎn)生氣泡；
[0090] 2.3 2.3用橡皮膠沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片和載玻片接觸的部位；
[0091 ] 2.4 2.4將玻片放入雜交儀中，濕潤原位雜交儀濕度條，插入濕條，蓋上雜交儀上 蓋，設(shè)置"Denat&Hyb"程序，變性85°C5分鐘，雜交37°C 10~18小時。（若無雜交儀，可使用替 代儀器，如恒溫?zé)崤_進(jìn)行變性，電熱烘箱/或水浴鍋進(jìn)行雜交，需注意溫度準(zhǔn)確及保持雜交 濕度）。
[0092] 3、雜交后洗滌及復(fù)染(避光操作）
[0093] 3.1洗滌前30分鐘，將配制好的洗液I，洗液II，放入37± 1°C的水浴中，測量以確保 溫度合適；
[0094] 3.2關(guān)閉雜交儀電源，將玻片取出，輕輕撕去橡皮膠，移去蓋玻片(若蓋玻片難以去 除，可以將其放入洗液I中微微搖晃，以利于其脫落；
[0095] 3 · 3玻片放入37 ± 1°C洗液I (2 X SSC)中10分鐘；
[0096] 3.4取出玻片，再將其放入37 ± 1°C洗液11(0.1 %NP-40/2 X SSC)中5分鐘；
[0097] 3.5取出玻片，室溫70 %乙醇中3分鐘；
[0098] 3.6取出玻片，暗處自然干燥玻片；
[0099] 3.7室溫，滴加10μ1 DAPI復(fù)染劑到22 X 22mm的蓋玻片，載玻片目標(biāo)區(qū)域朝下，輕放 于蓋玻片上，輕壓，避免產(chǎn)生氣泡，在暗處存放，待觀察。
[0100] 上述所列舉試劑均在圓形染色缸中配制(每種試劑體積均為40ml)，每個染色缸最 多可放入5片切片。非室溫溶液，在操作開始前需提前預(yù)熱反應(yīng)試劑至指定溫度。在洗滌過 程中，可間隔2~3分鐘輕輕晃動染色缸，提高洗滌效果。
[0101] 4、結(jié)果分析
[0102] 相關(guān)熒光和DAPI需用合適的濾塊觀察。其中，紅色信號示GSP HER-2,綠色信號示 GSPT0P2A