一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽藥物領(lǐng)域，具體涉及一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應(yīng)用，尤 其一種作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體的芋螺毒素多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌肉煙堿型乙酰膽堿受體存在于神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜，由5個(gè)亞單位組成，在 胎兒肌肉為α2βγδ，在成人肌肉為α2βεδ。當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)至運(yùn)動(dòng)終，突觸前膜釋放乙酰膽 堿，乙酰膽堿作用在突觸后膜乙酰膽堿受體的α亞單位，開啟離子通道，引起肌肉收縮。
[0003] 現(xiàn)在在美容界廣泛使用的Β0Τ0Χ(保妥適），即注射用Α型肉毒毒素，其作用機(jī)理正 是阻斷神經(jīng)末梢分泌能使肌肉收縮的乙酰膽堿，從而達(dá)到麻痹肌肉的效果。由于麻痹了肌 肉使得肌肉沒有跳動(dòng)能力而消除了皺紋，適用于暫時(shí)改善65歲及65歲以下成人因皺眉肌/ 或降眉間肌活動(dòng)引起的中度至重度皺眉紋。然而肉毒桿菌毒素是由肉毒桿菌在繁殖過程中 所產(chǎn)生的一種神經(jīng)毒素蛋白，價(jià)格較高。而且注射肉毒桿菌毒素有明顯的副作用，會(huì)產(chǎn)生頭 痛、過敏、復(fù)視、表情不自然的不良反應(yīng)，因此不適合廣泛使用。
[0004] 抗皺蛇毒SYN-AKE是由瑞士 DSM荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán)全資子公司PENTAPHARM通過 高科技生化科技，模擬Temple Viper毒蛇的血清中含有的Waglerinl蛋白，合成的三肽衍生 物。SYN-AKE為肌肉煙堿乙酰膽堿受體(nmAChR)拮抗劑，專門作用于肌肉煙堿乙醯膽堿突出 膜，通過競爭性結(jié)合乙酰膽堿受體亞基，阻斷乙酰膽堿與通道的結(jié)合，以達(dá)到抑制神經(jīng)肌肉 收縮之作用，在除皺方面有特效。但是相比肉毒桿菌SYN-AKE更安全有效。
[0005] 芋螺毒素（conotoxin或conopeptide，或CTX)，由海洋腹足綱軟體動(dòng)物芋螺 (Conus)的毒液管和毒囊內(nèi)壁的毒腺所分泌，由許多單一毒肽組成的雞尾酒樣的混合毒素， 主要成分是一些對(duì)不同離子通道及神經(jīng)受體高專一性的活性多肽化合物。它們能特異性地 作用于乙酰膽堿受體及其他神經(jīng)遞質(zhì)的各種受體亞型，以及鈣、鈉、鉀等多種離子通道。芋 螺毒素與蛇毒的作用機(jī)理基本一致，而芋螺毒素相對(duì)分子質(zhì)量更小、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、作用效果 更強(qiáng)、更易于合成。因而芋螺毒素在開發(fā)為抗皺產(chǎn)品方面更有優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā) 明所述芋螺毒素多肽能夠作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，且分子量更小、結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、作 用效果更強(qiáng)、更易于合成。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種芋螺毒素多肽，其氨基酸序列為ΗΡΑ。
[0009] 本發(fā)明還提供了在ΗΡΑ的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基 所得到的氨基酸序列的多肽。
[0010]本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明所述多肽的DNA分子。
[0011]本發(fā)明還提供了所述芋螺毒素多肽的制備方法，包括以下步驟：
[0012] 1)固相合成ΗΡΑ-氨基樹脂；
[0013] 2)ΗΡΑ-氨基樹脂裂解得到ΗΡΑ粗肽；
[0014] 3)ΗΡΑ粗肽用1%醋酸溶液溶解后，凝膠柱層析分離，反相高效液相色譜法純化得 到ΗΡΑ精肽。
[0015] 優(yōu)選的，所述固相合成為Fmoc-Arg(Pbf )-0Η和氨基樹脂反應(yīng)合成Fmoc-Arg(Pbf)-氨基樹脂，然后采用逐一偶聯(lián)的方式偶聯(lián)Fmoc保護(hù)基團(tuán)的其他氨基酸得到ΗΡΑ-氨基樹脂。 [0016]其中，所述氨基樹脂優(yōu)選為Rink Amide樹脂。
[0017] 本發(fā)明所述制備方法步驟2)所述裂解的裂解劑為氟乙酸、三異丙基硅烷與苯酚的 混合物。
[0018] 優(yōu)選的，所述三氟乙酸、三異丙基硅烷與苯酚的體積比為95:2.5:2.5。
[0019]本發(fā)明利用膜片鉗技術(shù)對(duì)上述篩選出的多肽進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示多肽ΗΡΑ能夠作 用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，有效的抑制乙酰膽堿受體。因此，本發(fā)明提供了所述多肽 ΗΡΑ作為肌肉煙堿乙酰膽堿受體拮抗劑的應(yīng)用。
[0020] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述多肽ΗΡΑ在制備抗皺化妝品中的應(yīng)用。
[0021] 由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應(yīng)用。本 發(fā)明所述芋螺毒素多肽其氨基酸序列為ΗΡΑ。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所述芋螺毒素多肽ΗΡΑ能 夠作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，有效的抑制乙酰膽堿受體，可作為肌肉煙堿乙酰膽堿 受體拮抗劑。本發(fā)明所述芋螺毒素多肽ΗΡΑ可以用于制備抗皺化妝品，應(yīng)用范圍廣泛，具有 良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效應(yīng)。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0023] 圖1示實(shí)施例2ΗΡΑ成品質(zhì)譜圖；
[0024] 圖2示實(shí)施例2ΗΡΑ成品高效液相色譜圖；
[0025]圖3示實(shí)施例4對(duì)比于陽性藥物，ΗΡΑ對(duì)于乙酰膽堿引起的電流的抑制圖，其中圖A 為加入ΙΟμπι乙酰膽堿引起的電流，圖B為加入ΙΟμπι乙酰膽堿后再加入ΙΟμπι陽性藥物引起的 電流，圖C為加入ΙΟμπι乙酰膽堿引起的電流，圖D為加入ΙΟμπι乙酰膽堿后再加入ΙΟμπι ΗΡΑ引 起的電流；
[0026] 圖4示實(shí)施例4ΝΡΑ、WNPA、GKYYS、GKHFN對(duì)于乙酰膽堿引起電流的作用圖，其中圖A、 C、E、G均為加入ΙΟμπι乙酰膽堿引起的電流，圖B為加入1 Ομπι乙酰膽堿后再加入1 Ομπι NPA引起 的電流，圖D為加入1 ΟμL?乙酰膽堿后再加入1 ΟμL? 了 WNPA引起的電流，圖F為加入1 ΟμL?乙酰膽 堿后再加入ΙΟμπι GKYYS引起的電流，圖Η為加入ΙΟμπι乙酰膽堿后再加入ΙΟμπι GKHFN引起的 電流；
[0027]圖5示實(shí)施例5對(duì)于乙酰膽堿引起的電流，ΗΡΑ的濃度效果曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0030] -種芋螺毒素多肽，其氨基酸序列為ΗΡΑ。
[0031] 現(xiàn)在已知的作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體的α-芋螺毒素多為10-20個(gè)氨基酸的 多肽，本發(fā)明通過生物信息學(xué)方法，篩選α3/5芋螺毒素半胱氨酸環(huán)內(nèi)小肽的序列在NCBI中 的blastp中進(jìn)行同源序列比對(duì)，對(duì)于有相同序列的蛋白和國際化妝品原料表(INCI)-一匹 配，將兩者均能匹配上序列作為候選的小肽。篩選出NPA，ΗΡΑ、WNPA、GKYYS、GKHFN。
[0032]人乙酰膽堿受體主要來源于臨床外科斷肢肌肉和表達(dá)人乙酰膽堿受體的人橫紋 肌肉瘤細(xì)胞ΤΕ 671細(xì)胞株。而膜片鉗技術(shù)則可以對(duì)電極尖端下面積僅為幾平方微米的細(xì)胞 膜片上一個(gè)或幾個(gè)離子通道的電流進(jìn)行記錄，從而檢測是否產(chǎn)生可引起肌肉收縮的動(dòng)作電 位。因此，本發(fā)明利用膜片鉗技術(shù)對(duì)上述篩選出的多肽進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示多肽ΗΡΑ能夠作 用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，有效的抑制乙酰膽堿受體。
[0033] 因此，本發(fā)明提供了一種芋螺毒素多肽，其氨基酸序列為ΗΡΑ。
[0034] 本發(fā)明還提供了在ΗΡΑ的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基 所得到的氨基酸序列的多肽。所述的氨基酸取代、缺失或添加，可以在氨基酸序列的任意位 點(diǎn)進(jìn)行