脂放于接肽瓶中，加入20%哌啶/DMF溶液脫Fmoc 保護基團2次，第一次反應5min，第二次反應15min，用DMF、DCM、甲醇洗滌干凈。然后按序列 HPA-NH2的順序依次接Fmoc保護的氨基酸，反應體系摩爾比為Fmoc-AA:DIC:H0Bt按1:1:1投 放，在此例中Fmoc-AA按樹脂量的3倍加入，每次DIC加4.10g左右，HOBt加4.27g左右。期間依 次用20 %哌啶/DMF脫除Fmoc保護基團2次，第一次反應5min，第二次反應15min;每一步氨基 酸縮合反應一次2-4小時，均采用Kaise Test檢測反應是否縮合完全，如顯色反應呈陽性重 復縮合該氨基酸，序列縮合最后直接脫除Fmoc保護基團，DMF、DCM、甲醇洗滌幾次。
[0072] 3、HPA粗品的制備
[0073] ΗΡΑ氨基樹脂用TFA: Tis :Phenol按體積比95:2 · 5:2 · 5的混合溶液處理肽樹脂3-4 小時，把肽從樹脂上切下來及切除側(cè)鏈保護基，濃縮至干后用冰乙醚析出固體，離心干燥得 粗品 30.26g。
[0074] 4、HPA成品的制備
[0075] ΗΡΑ粗品用1 %醋酸溶液溶解后，離心取上清過G10柱，以1 %醋酸溶液洗脫，在 220nm監(jiān)測，上樣量2.00g/次，流速為5mL · mirT1，收集有吸收的組分。將收集的精制液減壓 蒸餾，控制質(zhì)量濃度在l〇〇mg · ml/1左右時冷凍干燥。收集ΗΡΑ峰濃縮干燥得成品18.23g，純 度大于60 %，總收率達60 %。
[0076] 5、HPA成品的純化
[0077]將上述干燥所得成品使用C18反相柱用高效液相層析儀進行純化，檢測條件： 220nm。取上述干燥所得成品加注射用水溶解稀釋至80mg · ml/1,用0.45μηι微孔濾膜過濾，濾 液上制備型高效液相色譜儀，每次進微濾液3mL，分段收集主要吸收峰的流出液，隨時用高 效液相色譜儀檢測，以確保質(zhì)量合格。收集精制液，減壓濃縮至20mL。對該精制液進行質(zhì)譜 檢測結(jié)果見圖1。分子離子峰解析圖譜顯示ΗΡΑ的相對分子質(zhì)量為324.05,通過計算 HPAM.W.(Average)為323.35，在全掃描一級質(zhì)譜條件下，與單電荷測定值(1+!1)+相符，其余峰 均為碎片峰和鹽峰。
[0078]同時再對該精制液進行高效液相色譜進行純度的檢測，結(jié)果見圖2和表1。
[0079]表1純度檢測結(jié)果
[0080]
luucm」 t±j m 丄/ru衣丄術(shù) 夕匕，巾|」1 守口、jnrnp乂口口反 κι 以丄〇
[0082]實施例 3:合成多肽 ΝΡΑ、WNPA、GKYYS、GKHFN。
[0083] 分別按照實施例2所述方法合成多肽ΝΡΑ、WNPA、GKYYS、GKHFN。
[0084]實施例4:膜片鉗實驗
[0085] 檢測多肽ΝΡΑ、WNPA、GKYYS、GKHFN及ΗΡΑ對ΤΕ671乙酰膽堿受體離子通道電流的作 用。具體方法為:采用全細胞記錄方式檢測ΤΕ671細胞的nAChR離子通道電流。選擇質(zhì)膜光滑 可見、胞質(zhì)均勻的健康TE671細胞作為實驗細胞。與膜片鉗放大器相連的電極銀絲在實驗前 一周用次氯酸進行AgCl泛極化處理。電極充灌細胞內(nèi)液后用注射器加入少許正壓，用微電 極操縱器驅(qū)動電極入水。然后用微電極操縱器驅(qū)動電極接近細胞，電極尖端與細胞膜成45 度角接觸細胞，利用微調(diào)將電極靠近細胞，在電阻上升0.2ΜΩ時釋放正壓，然后稍加負壓， 電極與細胞膜之間就可形成高阻抗封接（1GQ以上）。補償消除電極快電容。將細胞膜電位 鉗制在-60mV，繼續(xù)給予負壓，將電極鉗制的細胞膜打破，形成全細胞記錄模式。補償消除細 胞慢電容。穩(wěn)定lmin，讓電極內(nèi)液和細胞膜內(nèi)成分之間相互平衡。
[0086] TE671 細胞鉗制電位(VH):-60mV;溫度：18-22°C。
[0087] Ach誘導的反轉(zhuǎn)電位為~OmV，電極電阻為5ΜΩ。細胞外液灌注流速為8-13mL · min-1。
[0088] 給藥模式:用磷酸緩沖溶液（1 X PBS，pH7.4)配制濃度為ImM的各多肽母液，于實驗 前取適量母液用細胞外液稀釋至測試濃度（1〇μΜ)。給予ACh激動受體，同時設置只加 ACh的 空白對照和加陽性藥類蛇毒三勝肽SYN-AKE的陽性對照，可見ΗΡΑ對于乙酰膽堿引起的電流 也有較好的抑制作用（圖3)而ΝΡΑ、WNPA、GYKKS、GKHFN對于乙酰膽堿引起電流的作用則不如 ΗΡΑ(圖 4)〇
[0089]實施例5:濃度效果曲線的繪制
[0090]對于有效的小肽ΗΡΑ采取倍比稀釋，制得濃度效果曲線。具體方法為:采用5種不同 濃度(0. ΙμΜ、ΙμΜ、ΙΟμΜ、100μΜ、1000μΜ)ΗΡΑ抑制乙酰膽堿刺激產(chǎn)生的電流，每種濃度檢測4 個細胞。實驗數(shù)據(jù)用cl ampf it (Axon，American)軟件分析，數(shù)據(jù)的進一步分析使用 Sigmap 1 〇t (s igma，Amer ican)軟件，得到濃度效果曲線，結(jié)果如圖5。根據(jù)方程擬合得到ΗΡΑ 的半有效抑制濃度(IC50)為9.2μΜ。
[0091]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明的進一步詳細說明，不能認定本發(fā) 明的具體實施只局限于這些說明。在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的 技術(shù)人員可以做出若干推演或替換，都應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種芋螺毒素多肽，其特征在于，其氨基酸序列為ΗΡΑ。2. 具有通過在權(quán)利要求1所述多肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基 酸殘基所得到的氨基酸序列的多肽。3. 編碼權(quán)利要求1或2所述多肽的DNA分子。4. 權(quán)利要求1所述多肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1)固相合成ΗΡΑ-氨基樹脂； 2 )ΗΡΑ-氨基樹脂裂解得到ΗΡΑ粗肽； 3 )ΗΡΑ粗肽用1 %醋酸溶液溶解后，凝膠柱層析分離，反相高效液相色譜法純化得到ΗΡΑ 精肽。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述固相合成為Fmoc-Arg (Pbf)-OH和氨基樹脂反應合成Fm〇C-Arg(Pbf)-氨基樹脂，然后采用逐一偶聯(lián)的方式偶聯(lián) Fmoc保護基團的其他氨基酸得到ΗΡΑ-氨基樹脂。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述氨基樹脂為Rink Amide樹脂。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述裂解的裂解劑為三氟乙 酸、三異丙基硅烷與苯酚的混合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述三氟乙酸、三異丙基硅烷與苯酚 的體積比為95:2.5:2.5。9. 權(quán)利要求1或2所述多肽作為肌肉煙堿乙酰膽堿受體拮抗劑的應用。10. 權(quán)利要求1或2所述多肽在制備抗皺化妝品中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽藥物領(lǐng)域，具體涉及一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應用，尤其一種作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體的芋螺毒素多肽。本發(fā)明所述芋螺毒素多肽其氨基酸序列為HPA。實驗結(jié)果表明本發(fā)明所述芋螺毒素多肽HPA能夠作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，有效的抑制乙酰膽堿受體，可作為肌肉煙堿乙酰膽堿受體拮抗劑。本發(fā)明所述芋螺毒素多肽HPA可以用于制備抗皺化妝品，應用范圍廣泛，具有良好的經(jīng)濟和社會效應。
【IPC分類】C07K1/06, C07K1/04, A61K8/64, A61Q19/00, C07K5/097
【公開號】CN105566448
【申請?zhí)枴緾N201610131386
【發(fā)明人】華洋林, 梁東, 李莉楠, 唐健
【申請人】無限極（中國）有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月8日