0027]優(yōu)選地，所述的基因工程抗體包含F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab) '片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段和Fc片段 中的一種，上述各片段中兩種以上的組合，或上述各片段中的至少一種與其它蛋白或肽鏈 形成的衍生物。
[0028] 優(yōu)選地，所述的基因工程抗體的重鏈⑶R 3區(qū)序列為DFSWRGYYMDV，輕鏈⑶R3區(qū)序 列為 QQYGSSPRT。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種編碼特異性抑制連接蛋白26的全人抗體的核酸序列，其序列 為SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4。
[0030] 優(yōu)選地，所述的核苷酸序列編碼上述的特異性抑制連接蛋白26的全人抗體。
[0031] 本發(fā)明還提供了上述的特異性抑制連接蛋白26的全人抗體或基因工程抗體在制 備用于治療與連接蛋白26突變導(dǎo)致的耳聾、皮膚病或者腫瘤的藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種用于治療耳聾、皮膚病或者腫瘤的藥物，其包含上述的特異 性抑制連接蛋白26的全人抗體或基因工程抗體作為活性成份。
[0033]本發(fā)明的特異性抑制連接蛋白26的全人抗體命名為Anti-CX26-SCFvII-F C，經(jīng)過(guò) 檢測(cè)單鏈抗體對(duì)連接蛋白選擇性結(jié)合，并可特異性抑制該連接蛋白形成的半離子通道，是 經(jīng)過(guò)多輪噬菌體庫(kù)篩選獲得。與目前臨床應(yīng)用常見IgG類抗體不同，Anti-C X26-SCFvII-FC 為重組單鏈抗體，因此具有不同于IgG的抗體結(jié)構(gòu)、生化特性和生物學(xué)功能。我們的實(shí)驗(yàn)證 明，Anti-Cx26-scFvII-Fc單鏈抗體分子量大約lOOKd，識(shí)別、結(jié)合祀抗原表位為連接蛋白胞 外區(qū)結(jié)構(gòu)，特異識(shí)別過(guò)表達(dá)連接蛋白26的細(xì)胞系，且抗體與連接蛋白26在細(xì)胞表面共定位。 功能實(shí)驗(yàn)顯示Anti-Cx26-scFvII-Fc能夠抑制連接蛋白26半離子通道的活性。單獨(dú)使用該 抗體的免疫組化染色即可較為準(zhǔn)確地診斷各種組織中人源連接蛋白26的表達(dá)情況。綜上 Anti-C X26-SCFvII-FC單鏈抗體在耳聾、皮膚病和腫瘤的治療方面和連接蛋白26診斷試劑 方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[0034]本發(fā)明用人連接蛋白2 6胞外區(qū)第4 1 - 5 6氨基酸序列為抗原，序列為 KEVWGDEQADFVCNTL。通過(guò)單鏈抗體噬菌體展示庫(kù)及篩選技術(shù)獲得，通過(guò)對(duì)該抗體的生化分 析和免疫熒光鑒定，確定本發(fā)明提供的抗體能特異性識(shí)別連接蛋白26,并抑制其形成的半 通道活性。動(dòng)物試驗(yàn)表明，該抗體對(duì)鼠耳蝸組織切片的半通道活性有顯著抑制作用。因此， 該抗體可用于連接蛋白突變相關(guān)疾病治療。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1.單鏈抗體的篩選和序列驗(yàn)證。
[0036] A.抗體富集后抗體庫(kù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)抗原結(jié)合活性
[0037] B.挑取抗體單克隆與抗原結(jié)合酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)
[0038] 圖2.單鏈抗體的結(jié)構(gòu)及生化活性鑒定。
[0039] A.scFv-Fc型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。
[0040] B.Western blot檢測(cè)單鏈抗體分子量大小約為58KDa [0041 ] C.scFv II-Fc抗體熱穩(wěn)定性檢測(cè)
[0042] 0.質(zhì)譜分析雙鏈結(jié)構(gòu)4拉丨-〇126-8。?￥11^^分子量大小為105140.3
[0043] 圖3.Anti-Cx26_scFv II-Fc抗體與抗原親和力檢測(cè)。
[0044] A.酶聯(lián)免疫反應(yīng)鑒定抗體scFvII -Fc與抗原親和力
[0045] B. SRP法檢測(cè)抗體與Cx26蛋白相互作用，結(jié)果顯示Anti_Cx26_scFv II-Fc抗體與 Cx26的結(jié)果活性KD為7.3E10-8M
[0046] 圖4.免疫熒光檢測(cè)Anti-Cx26-scFv II-Fc抗體與Cx26-GFP蛋白，結(jié)果顯示兩個(gè)蛋 白共定位。
[0047]圖5.去極化激活Cx26離子通道后，利用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)Anti-Cx26-SCFv II-Fc抗 體阻礙Cx26離子半通道的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0049] 實(shí)施例1、單鏈抗體的篩選和單鏈抗體的表達(dá)純化
[0050] 1、所用材料：
[0051 ] (1)生物素化抗原多肽，（序列為:KEVWGDEQADFVCNTL，序列表SEQ ID N0:5,下稱抗 原），合成自金斯瑞公司。（2)全人單鏈抗體噬菌體展示庫(kù)，實(shí)驗(yàn)室自有。（3)鏈霉親和素化的 磁珠購(gòu)自賽默飛公司。（4)高吸附酶聯(lián)免疫反應(yīng)微孔板購(gòu)自康寧公司。（5)Anti-M13HRP抗體 購(gòu)自賽默飛公司。（6)輔助噬菌體購(gòu)自Life Technologies，貨號(hào)18311019 JTWLI-Blue細(xì) 菌購(gòu)自Agilent Technologies，貨號(hào)200228。（8)顯影液ABTS溶液購(gòu)自賽默飛公司，貨號(hào) 002024。
[0052] 2、實(shí)驗(yàn)方法：
[0053]表達(dá)全人單鏈抗體的噬菌體展示庫(kù)200微升(含有噬菌體粒1 X 1011個(gè))與5微克抗 原混合后室溫孵育30分鐘，再加入50微升的鏈霉親和素化的磁珠。與抗原結(jié)合的噬菌體被 鏈霉親和素化的磁珠捕獲，未結(jié)合的噬菌體經(jīng)PBST漂洗后去除，用鹽酸甘氨酸(pH 2.2)溶 液將與磁珠穩(wěn)定結(jié)合的·菌體洗脫待用。接種XLl-Blue細(xì)菌(Agilent Technologies，貨號(hào) 200228 )200毫升，待0D達(dá)到0.6后，加入上述洗脫的噬菌體與XLl-Blue細(xì)菌37 °C靜置30分 鐘，后在30攝氏度條件下過(guò)夜擴(kuò)增，離心收集細(xì)菌后，加入30微升輔助噬菌體(含有輔助噬 菌體粒1 X 1011個(gè))擴(kuò)增后進(jìn)行下一輪淘選。重復(fù)上述篩選步驟3-4輪，將侵染噬菌體的XLl-Blue 菌液經(jīng)過(guò)充分稀釋后涂 10cm 平板，每個(gè)板上有 100-500 個(gè)克隆 ，挑取單克隆 ，通過(guò)噬菌 體酶聯(lián)免疫反應(yīng)對(duì)淘選后的各輪噬菌體庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0054]噬菌體酶聯(lián)免疫反應(yīng)步驟為，將侵染噬菌體的XLl-Blue單克隆菌接種進(jìn)200微升 的96孔板中，200rpm 37°C搖4-6小時(shí)，檢測(cè)0D接近0.6后，加入1微升的輔助噬菌體，繼續(xù)30 °C搖過(guò)夜。第二天3000g離心取上清待用。取96低透平底微孔板，包被抗原過(guò)夜，第二天加入 上一步制備好的噬菌體上清，室溫孵育2小時(shí)，再加入Anti-M13 HRP抗體孵育30分鐘，后用 PBST洗3次，加入50微升顯影液ABTS。
[0055]由抗原的酶聯(lián)免疫反應(yīng)結(jié)果可以看出隨著淘選的進(jìn)行，酶聯(lián)免疫反應(yīng)的信號(hào)不斷 升高，而對(duì)照抗原(AcroBiosystems公司，貨號(hào)CD0-H82F2)的信號(hào)仍然比較低，在第四輪淘 選后，抗原的信號(hào)強(qiáng)度是對(duì)照抗原的多倍，說(shuō)明經(jīng)過(guò)4輪淘選，能夠表達(dá)與抗原特異性結(jié)合 抗體的噬菌體不斷的被富集。從淘選后的第三、四輪庫(kù)中挑取單克隆，最后確定酶聯(lián)免疫反 應(yīng)讀值是對(duì)照兩倍以上的克隆作為陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆測(cè)序分析，經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，確定不同 的抗體序列和富集情況。
[0056] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0057]如圖1A所示，多肽抗原CB在全人抗體噬菌體展示庫(kù)中進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)4輪淘選后， 酶聯(lián)免疫反應(yīng)的信號(hào)與對(duì)照組相比不斷升高，從淘選后的庫(kù)中挑取700個(gè)單克隆進(jìn)行酶聯(lián) 免疫反應(yīng)驗(yàn)證，最后確定酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀值是對(duì)照兩倍以上的克隆作為陽(yáng)性克隆，如圖1B 所示，150個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序分析，經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，重復(fù)次數(shù)越多，說(shuō)明該抗體序列的親和力越 強(qiáng)，依此確定有效富集序列。本發(fā)明中所選的陽(yáng)性克隆在150個(gè)克隆序列中重復(fù)84次，說(shuō)明 親和力較強(qiáng)。
[0058]挑取的克隆經(jīng)測(cè)序，所選的陽(yáng)性克隆的核酸序列為SEQ ID N0:3。
[0059] 實(shí)施例2、單鏈抗體純化和生化特性檢測(cè)
[0060] 1、所用材料：
[0061 ] (1 )Sypro Orange染料購(gòu)自賽默飛公司。（2)pFUSE表達(dá)載體pFUSE-hIGgl-FC2購(gòu)自 Invivogen公司，貨號(hào)pfuse_hglfc2。（3)HiTrapProteinA HP columns購(gòu)自GE公司。（4) ilKTApurifier! 蛋白純化儀購(gòu)自GE公司。（5)實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自BioRad公司。（6)質(zhì)粒抽 提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。（7)BCA蛋白定量試劑盒（Pierce? BCA Protein Assay kit， PiercettSSSSShM^amHl和Bglll限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。
[0062] 2、實(shí)驗(yàn)方法：
[0063]將實(shí)施例1得到的陽(yáng)性序列（即SEQ ID N0:3)由全基因合成（南京金斯瑞生物公 司）并在序列兩端加入BamHl和Bgin酶切位點(diǎn)，將得到的核酸序列經(jīng)過(guò)參照NEB說(shuō)明書在 BamHl和Bgin酶切后插入pFUSE-hIGgl-FC2表達(dá)載體（Invivogen公司，操作步驟請(qǐng)參照說(shuō) 明書），將獲得具有Fc段的單鏈抗體Anti-C X26-SCFvII-FC的真核抗體表達(dá)質(zhì)粒。利用 293Fectin轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，貨號(hào)12347500)與上述獲得的真核抗體表達(dá)載體質(zhì) 粒按照體積質(zhì)量比30微升：15微克的比例混合后加入30毫升的293Fre estyle懸浮細(xì)胞(購(gòu) 自賽默飛公司）后，37°C1200rpm搖過(guò)夜，離心后收集上清，采用HiTrap Protein A HP (：〇1111118在入0:44>1?、迅$『].00蛋白純化儀上進(jìn)行抗體蛋白純化(厶111:;[-0126-80?￥11-?(3)，最后 用BCA法蛋白定量試劑盒(Pierce，貨號(hào)23252)參照說(shuō)明書檢測(cè)抗體濃度。
[0064]將所得的純化抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，具體為：將5微克純化抗體樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，電泳電壓110V，60分鐘，后轉(zhuǎn)印到醋酸纖維素膜上，用羊抗人辣根過(guò)氧化物 酶二抗(購(gòu)自賽默飛)雜交，洗膜加入顯影液(Pierce公司，貨