號35055)成像。
[0065] 將所得的純化抗體進行熱穩(wěn)定性檢測，具體為:將純化抗體稀釋至0.1毫克/毫升， 按照體積比1: 2000加入Sypro Orange染料后密封，實時定量PCR儀(BioRad)設置程序溫度 由25 °C升至90 °C，0.5 °C每分鐘。同時檢測熒光值。
[0066] 將所得的純化抗體進行LC-MS質(zhì)譜分析，具體為:將純化的抗體5微克與1微升蛋白 質(zhì)脫糖酶（購自NEB公司，貨號P0709S)混合37°C -小時后，上樣到高分辨質(zhì)譜用儀器 Agilent 6230T0F LC/MS檢測。
[0067] 3、實驗結果：
[0068] 將實施例1得到的抗體的核酸序列（SEQ ID N0:3)經(jīng)過酶切插入pFUSE-hIGgl-FC2 表達載體，得到含有Fc段的scFv II DNA序列（SEQ ID N0:4)，其能夠編碼特異性抑制連接 蛋白26的全人單鏈抗體(Anti-Cx26-scFvII_Fc，序列為Seq ID N06)，即所述的特異性抑制 連接蛋白26的全人抗體為重組免疫球蛋白，結構為scFv-Fc，如圖2A所示，scFv指的是單鏈 抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:1，其輕鏈 可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:2,其重鏈⑶R 3區(qū)序列為DFSWRGYYMDV，輕鏈⑶R3區(qū)序列 為QQYGSSPRT，F(xiàn)c指的是恒定區(qū)，所述的恒定區(qū)包括CH2恒定區(qū)和CH3恒定區(qū)。所述的特異性 抑制連接蛋白26的全人抗體特異識別連接蛋白26的胞外區(qū)第41-75氨基酸部分。
[0069] Western blot實驗結果如圖2B所示，膠圖在58Kd處出現(xiàn)明顯條帶，說明抗體能特 異識別Cx26蛋白。熱穩(wěn)定性結果計算出該抗體的Tm值為65°C，如圖2(：所示，說明Anti-Cx26-scFvII-Fc抗體具有高穩(wěn)定性。如圖2D所示，LC-MS質(zhì)譜分析結果顯示該抗體蛋白的分子量 為105140道爾頓。
[0070] 實施例3、酶聯(lián)免疫反應檢測單鏈抗體與連接蛋白26的結合
[0071] 1、所用材料：
[0072] 1.CBS抗原固定溶液購自賽默飛公司。2.Anti-Human Fc HRP二抗購自賽默飛公 司。3.顯影底物ABST溶液購自賽默飛公司。4.檢測用96孔底透板購自Coming公司。
[0073] 2、實驗方法：
[0074] 96孔底透板每孔加入50微升CBS抗原固定溶液稀釋的Cx26抗原多肽(金斯瑞公司 合成，序列請見Seq ID N05)，抗原每孔0.05微克，4°C過夜孵育，室溫震蕩孵育30分鐘，PBS 漂洗三次，含5 %牛奶的PBST溶液，37 °C條件下封閉60分鐘。PBS漂洗三次，加入實施例2所得 的Anti-Cx26-scFvII-Fc抗體，37°C條件下孵育60分鐘。漂洗干燥后，加入Anti-Human Fc二 抗，室溫震蕩孵育30分鐘，PBS漂洗三次，最后加底物顯色，酶標儀讀值。
[0075] 3、實驗結果：
[0076]如圖3A所示，陰性對照孔酶聯(lián)免疫反應讀值0D值均在0.2以下，而陽性孔0D值在 0.4以上。根據(jù)結果獲得150個陽性克隆孔。
[0077]實施例4、SRP法檢測單鏈抗體與連接蛋白26的結合 [0078] 1、所用材料：
[0079] 1.Octet RED儀器及其檢測芯片CM5芯片購自Pall公司。2.Anti-human IgG抗體購 自賽默飛公司。
[0080] 2、實驗方法：
[0081]通過多循環(huán)動力學的方法檢測抗體與抗原親和力與動力學?？贵w固定采用捕獲法 進行，先將4]11:;[-11111]^111〖6抗體偶聯(lián)在015芯片上，然后將待測的4111:;[-0126-80?￥11-?(3抗 體樣品稀釋梯度后流過芯片表面，待測抗體就會被已經(jīng)偶聯(lián)的抗人Fc抗體所捕獲。隨后再 注入抗原多肽（由南京金斯瑞公司合成，序列為Seq ID N0:5)，抗原與抗體結合后信號被檢 測并記錄。最后用再生試劑(PH1.7的甘氨酸溶液)將CM5芯片表面的抗體和抗原樣品全部洗 脫，并進行新一輪檢測。
[0082] 3、實驗結果：
[0083] 如圖313所示，SRP法檢測抗體與Cx26蛋白相互作用，顯示Anti-Cx26_scFv II-Fc抗 體與Cx26的結果活性KD為7.3E10-8M。
[0084]實施例5、細胞免疫熒光檢測抗體特異識別Cx26蛋白 [0085] 1、所用材料：
[0086] (l)HeLa DH細胞購自西格瑪公司。（2)Cx26-Venus_YFP報告基因質(zhì)粒購買自 Addgene公司，貨號69016。（3)焚光二抗Alexa Fluor 594goat anti-human購自賽默飛公 司。（4)焚光共聚焦顯微鏡購自徠卡公司。
[0087] 2、實驗方法：
[0088] HeLa DH細胞用293Fectin(賽默飛）參照說明書步驟轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Cx26-Venus-YFP，該 質(zhì)?？稍诩毎ど媳磉_人源Cx26蛋白且伴隨綠色熒光，用2%甲醛固定細胞，室溫條件下放 置10分鐘。漂洗后，加入含2%BSA的PBS溶液封閉細胞30分鐘，1毫克/毫升Anti-Cx26-scFvII-Fc抗體溶液用1 %BSA/PBS以稀釋比1:500稀釋后孵育細胞4~5小時，漂洗后，加入 焚光Alexa Fluor 594 goat anti-human二抗在溶液1%BSA/PBS中以1:1000濃度稀釋，室 溫條件下孵育60分鐘后，加入DAPI(1微克/毫升)孵育5分鐘，漂洗后，封片，激光共聚焦顯微 鏡觀察及拍照。
[0089] 3、實驗結果：
[0090] 如圖4所不，Anti-Cx26_scFv II-Fc抗體與Cx26_GFP兩個蛋白共定位。
[0091 ]實施例6、膜片鉗技術檢測抗體抑制Cx26半通道活性 [0092] 1、所用材料：
[0093] (l)HeLa DH細胞購自西格瑪公司。（2)Cx26-Venus_YFP報告基因質(zhì)粒購買自 Addgene公司，貨號69016。（3)全自動膜片鉗系統(tǒng)購自美國1?(3公司。
[0094] 2、實驗方法：
[0095] HeLa DH細胞用293Fectin(賽默飛）參照說明書步驟轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Cx26-Venus-YFP，膜 片鉗采用全細胞式記錄單個細胞膜離子電流，細胞處理上清中加入940nM的Anti-Cx26-scFv II-Fc抗體，對照組Zn2+濃度100uM，不加抗體作為空白對照組，加大電壓至40毫伏使細 胞去極化導致Cx26半通道開放，記錄加入抗體的實驗組，陽性對照組和空白對照組的半通 道電流，降低電壓至負40毫伏使細胞處于超極化狀態(tài)，并同時記錄各組的半通道電流。 [0096] 3、實驗結果：如圖5所示，抗體Anti-Cx26-scFv II-Fc可有效抑制Cx26半通道活 性，是非特異抑制劑Zn2+的一百倍。
【主權項】
1. 一種特異性抑制連接蛋白26的全人抗體，其特征在于，其為重組免疫球蛋白，結構為 SCFV-FC，SCFv指的是單鏈抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序 列為SEQ ID N0:1，其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:2，F(xiàn)c指的是恒定區(qū)。2. 如權利要求1所述的特異性抑制連接蛋白26的全人抗體，其特征在于，所述的恒定區(qū) 包括CH2恒定區(qū)和CH3恒定區(qū)。3. 如權利要求1所述的特異性抑制連接蛋白26的全人抗體，其特征在于，所述的特異性 抑制連接蛋白26的全人抗體特異識別連接蛋白26的胞外區(qū)第41-75氨基酸部分。4. 一種基因工程抗體，其特征在于，其與權利要求1-3中任一項所述的特異性抑制連接 蛋白26的全人抗體的單鏈抗體具有30%以上的同源序列。5. 如權利要求4所述的基因工程抗體，其特征在于，所述的基因工程抗體包含F(xiàn)ab片段， F(ab) '片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段和Fc片段中的一種，上述各片段中兩種以上的組合，或上述各 片段中的至少一種與其它蛋白或肽鏈形成的衍生物。6. 如權利要求4所述的基因工程抗體，其特征在于，所述的基因工程抗體的重鏈CDR 3 區(qū)序列為DFSWRGYYMDV，輕鏈CDR3區(qū)序列為QQYGSSPRT。7. -種編碼特異性抑制連接蛋白26的全人抗體的核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO:3 或SEQ ID NO:4。8. 權利要求1-3中任一項所述的特異性抑制連接蛋白26的全人抗體或權利要求4-6中 任一項所述的基因工程抗體在制備用于治療與連接蛋白26突變導致的耳聾、皮膚病或者腫 瘤的藥物或試劑盒中的應用。9. 一種用于治療耳聾、皮膚病或者腫瘤的藥物，其包含權利要求1-3中任一項所述的特 異性抑制連接蛋白26的全人抗體或權利要求4-6中任一項所述的基因工程抗體作為活性成 份。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種特異性抑制連接蛋白26的全人抗體，其特征在于，其為重組免疫球蛋白，結構為scFv-Fc，scFv指的是單鏈抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ？ID？NO：1，其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ？ID？NO：2，F(xiàn)c指的是恒定區(qū)。本發(fā)明用人連接蛋白26胞外區(qū)第41-56氨基酸序列為抗原，序列為KEVWGDEQADFVCNTL。通過單鏈抗體噬菌體展示庫及篩選技術獲得，通過對該抗體的生化分析和免疫熒光鑒定，確定本發(fā)明提供的抗體能特異性識別連接蛋白26，并抑制其形成的半通道活性。動物試驗表明，該抗體對鼠耳蝸組織切片的半通道活性有顯著抑制作用。因此，該抗體可用于連接蛋白突變相關疾病治療。
【IPC分類】A61P35/00, C12N15/13, A61P27/16, A61P17/00, C07K16/18, A61K39/395
【公開號】CN105566495
【申請?zhí)枴緾N201610056295
【發(fā)明人】曲志虎, 楊光, 法比奧馬馬諾, 范思科
【申請人】上海科技大學
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月27日