miR-331-5p作為急性HIV感染檢測(cè)標(biāo)志物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011 本發(fā)明涉及一種急性HIV感染檢測(cè)標(biāo)志物，具體地說(shuō)是miR-331-5p作為急性HIV感 染檢測(cè)標(biāo)志物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染所致的疾病，HIV感染后，病毒大量吞噬、 破壞T4淋巴細(xì)胞，從而使整個(gè)人體免疫系統(tǒng)遭到破壞，最終人體喪失對(duì)各種疾病的抵抗能 力而導(dǎo)致死亡。根據(jù)中國(guó)疾控中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，截至2015年10月底，全國(guó)報(bào)告存活的艾滋病 病毒感染者和病人共計(jì)57.5萬(wàn)例，死亡17.7萬(wàn)人。艾滋病不僅影響廣大人民群眾的生命健 康，也給社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重危害。
[0003] 急性HIV感染的診斷有利于早期發(fā)現(xiàn)和治療，在艾滋病的防治工作中具有重要作 用。急性HIV感染時(shí)，HIV抗體尚未充分產(chǎn)生，診斷主要依靠 HIV抗原和核酸檢測(cè)，HIV抗原檢 測(cè)的敏感性為30~90%，僅為HIV感染的輔助診斷依據(jù)，而HIV核酸檢測(cè)的價(jià)格昂貴。有關(guān)急 性HIV感染的診斷方法有待進(jìn)一步提高和完善(Hoenigl M et al ·，Costs per Diagnosis of Acute HIV Infection in Community-based Screening Strategies:A Comparative Analysis of Four Screening Algorithms.Clin Infect Dis 2015；pi i:civ912.)〇
[0004] 由于microRNA能以穩(wěn)定的形式廣泛存在于包括血液、唾液和尿液等體液中，是一 種重要的生物標(biāo)志物。因此，循環(huán)miRNA可以作為潛在的血液生物標(biāo)記物，用于疾病檢測(cè)，其 優(yōu)勢(shì)在于非侵入性地提取組織標(biāo)本。研究顯示，microRNA作為一種潛在的疾病診斷生物標(biāo) 記物，在腫瘤、心血管疾病、糖尿病和感染性疾病診斷以及司法鑒定中具有重要的作用 (Faruq 0 et al.,microRNA:Diagnostic Perspective . Front Med(Lausanne)2015；2: 51.doi:10.3389/fmed.2015.00051.)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種檢測(cè)miR-331-5p表達(dá)水平的物質(zhì)的新用途。
[0006] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種含有上述物質(zhì)的診斷或輔助診斷急性HIV感染的 試劑盒。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 檢測(cè)miR-331-5p表達(dá)水平的物質(zhì)在制備診斷或輔助診斷急性HIV感染患者產(chǎn)品中 的用途，其中，所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0009] 檢測(cè)miR-331-5p表達(dá)水平的物質(zhì)在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)急性HIV感染的產(chǎn)品中的 用途，其中，所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。具體序列如下所示：
[0010] SEQ ID No.lCUAGGUAUGGUCCCAGGGAUCC
[0011] 所述檢測(cè)miR-331-5p表達(dá)水平的物質(zhì)為如下a)或b)或c):
[0012] a)擴(kuò)增所述miR-331-5p的引物和/或探針；
[0013] b)含有所述a)的PCR試劑組；
[0014] c)含有所述a)或所述b)的試劑盒。
[0015] 所述引物包括序列如SEQ ID No.3所示的上游引物;及序列如SEQ ID No.4所示的 下游引物。
[0016] 上述具體序列如下：
[0017] SEQ ID No.3miR-331-5p-F：
[0018] GGCCTAGGTATGGTCCCAG
[0019] SEQ ID No.4miR-331-5p-R：
[0020] GTGCAGGGTCCGAGGT〇
[0021] miR-331-5p作為標(biāo)志物在制備診斷或輔助診斷急性HIV感染患者產(chǎn)品中的用途， 所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0022] 一種檢測(cè)miR-331-5p表達(dá)水平的物質(zhì)，其中，所述檢測(cè)miR-331-5p表達(dá)水平的物 質(zhì)為如下a)或b)或c):
[0023] a)擴(kuò)增所述miR-331_5p的引物和/或探針；
[0024] b)含有所述a)的PCR試劑組；
[0025] c)含有所述a)或所述b)的試劑盒。
[0026] 所述擴(kuò)增miR-331-5p的引物包括序列如SEQIDN0.3所示的上游引物，及序列如 SEQ ID No.4所示的下游引物。
[0027] -種診斷或輔助診斷急性HIV感染的試劑盒，其中，所述試劑盒包含上述的檢測(cè) miR-331-5p表達(dá)水平的物質(zhì)。
[0028] 所述試劑盒組成為:上述SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物和PCR反應(yīng)液。
[0029] 所述PCR反應(yīng)液 12.5yL，其由Syber green I熒光染料0.5_1X、DNA聚合酶 100U/mL、 dNTPs 0.2mM、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽16.5mM、氯化鉀89.3mM、氯化鎂6mM和水組成。
[0030] 試劑盒中上游引物（SEQ ID Νο.3)(10μΜ)1μL，下游引物（SEQ ID Νο.4)(10μΜ)1μ L〇
[0031] 所述試劑盒還可以包括逆轉(zhuǎn)錄引物及內(nèi)參體系，所述逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID No.2所示;所述內(nèi)參為U6,內(nèi)參體系包括針對(duì)U6的逆轉(zhuǎn)錄引物及檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物序列 如SEQ ID No.5所示；檢測(cè)引物序列如SEQ ID No.6及SEQ ID No.7所示。
[0032] 上述miR-331-5p表達(dá)水平為血漿表達(dá)水平。
[0033]本發(fā)明的有益效果如下：
[0034] 本發(fā)明利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，待測(cè)樣品為待測(cè)者血漿，通過(guò)檢測(cè)被測(cè)血漿中miR-331-5p的含量，并通過(guò)與正常人群miR-331-5p水平比較以診斷急性HIV感染。本發(fā)明提出的 急性HIV感染標(biāo)志物miR-331-5p預(yù)測(cè)急性HIV感染的AUC是0.941 (95 %置信區(qū)間：0.0.867-1. 〇〇〇 )，敏感度和準(zhǔn)確度均為90 %。靈敏性高，特異性強(qiáng)，操作方便，有利于臨床應(yīng)用。本發(fā) 明所建立的急性期HIV感染診斷方法，為HIV感染的早期診斷提供了重要的參考依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為U6和miR-331-5p的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036]圖2為血衆(zhòng)miR-331-5p在HIV感染前后表達(dá)水平比較示意圖。與HIV感染前相比，血 衆(zhòng)miR-331-5p在HIV感染后顯著升高。P = 0.001。
[0037] 圖 3為血衆(zhòng)miR-33 l_5p診斷急性HIV感染的ROC曲線（Recei ver operat ing characteristic curve，R0C curve)及曲線下面積（Area under the curve，AUC)。圖中顯 示了急性HIV感染的ROC曲線、AUC、靈敏度(Sensitivity)和準(zhǔn)確度(Specificity)。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 實(shí)施例1臨床血漿標(biāo)本miR-331-5p表達(dá)與急性HIV感染的相關(guān)性實(shí)用性驗(yàn)證
[0041] 1.材料與標(biāo)本收集描述
[0042] 標(biāo)本均來(lái)自于佑安醫(yī)院男男同性戀高危人群動(dòng)態(tài)隨訪隊(duì)列，每隔2個(gè)月隨訪一次， 采集全血后分離血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞凍存，選取20例急性HIV感染者感染前后的標(biāo)本， 這些感染者均排除合并梅毒、乙肝和丙肝。
[0043] 2.血漿 miRNA 提取
[0044] 血衆(zhòng)RNA通過(guò)Qiagen的miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒按照試劑盒說(shuō)明書操 作步驟進(jìn)行提取和純化，具體步驟如下：
[0045] 2.1解凍凍存的血漿樣本。
[0046] 2.2每10(^1^樣本中加入50(^1^(>)]^2〇11^8丨8 1^386111:試劑，采用移液器反復(fù)吹打 混勻。
[0047] 2.3將混勻樣品在室溫下孵育5分鐘。
[0048] 2 · 4加入100yL氯仿，振蕩混勻15秒。
[0049] 2.5室溫孵育2~15分鐘。
[0050] 2.6在12000\8,4。(3下離心15分鐘。
[0051] 2.7將上層液相物質(zhì)轉(zhuǎn)移至新的試管，在操作時(shí)避免吸入任何中間相或有機(jī)層物 質(zhì)；加入150yL100%乙醇，采用移液器反復(fù)吹打混勻。
[0052] 2.8將樣本加入RNeasy Mini spin小柱以10000Xg離心力，室溫離心15秒。棄過(guò)濾 液。
[0053] 2.9重復(fù)2.8步驟離心一次。
[0054] 2 · 10加入700yL RWT緩沖液，以10000 X g離心力，室溫離心15秒。棄過(guò)濾液。
[0055] 2.11加入50(^1^1?^緩沖液，以10000\8離心力，室溫離心15秒。棄過(guò)濾液。
[0056] 2.12重復(fù)2.11步驟離心一次。
[0057] 2.13將RNeasy Mini spin小柱置于新的2mL離心管，12000g離心2分鐘。
[0058] 2.14將RNeasy Mini spin小柱置于新的 1.5mL離心管，30_50yL RNase-free水，以 10000 Xg離心力，離心1分鐘。將RNA洗脫備用。
[0059] 3.RNA 反轉(zhuǎn)錄<