br>[0060] 3.1在冰上融化RNA，室溫下融化Buffer Mix和RNasefree水。
[0061] 3.2在冰上配制反轉(zhuǎn)錄混合液:Buffer Mix 10yL，miRNA.Pri.meS:cr_ipt_?RT enzyme Mix 2yL，0.1%BSA 2yL，模板RNA lyL，最后加入適量RNase-free水將總體積調(diào)至20yL。
[0062] 3.3將PCR管中的逆轉(zhuǎn)錄混合液置于ABI7900HT型定量PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄反應，在37 °C孵育60分鐘，在85°C下孵育5秒。
[0063] 3 · 4將逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物(cDNA)置于-20°C備用。
[0064] 4.實時熒光定量PCR檢測miR-331-5p表達水平
[0065] 4.1反應體系配置：2X qPCR Mix 12.5yL，上游引物lyL，下游引物lyL，cDNA5yL， RNase-free水5·5yL〇
[0066] 4.2反應條件為:37°(3-20分鐘，95°(3-10分鐘；（95°(315秒，60°(31分鐘）-40個循 環(huán)。
[0067] 4.3將PCR反應板置于快速熒光定量PCR儀(7900HT)，按照4.2反應條件進行擴增。
[0068] 4.4制作標準曲線：上述檢測完成后，拷貝數(shù)以10為底取對數(shù)作為橫坐標，Cq值作 為縱坐標作圖，繪制標準曲線，計算斜率S，根據(jù)公式E = 10(_1/s)-l，計算擴增效率E。
[0069] 4.5計算:選中樣本和校對樣本檢測孔，應用實時定量PCR儀的隨機軟件得出樣本 閾值Cq和校對樣本閾值Cq，根據(jù)公式Q= (E+l "eq，Δ Cq = [Cq⑴_Cq(C)]，得出基因的校正 起始拷貝數(shù)Q，將miR-331-5p的Q值，與內(nèi)參基因 U6的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到miR-331-5p的相對表達量。
[0070] 5 ·統(tǒng)計分析miR-331-5p相對表達量
[0071] 采用t檢驗比較HIV感染前后miR-331-5p表達的差異，R0C曲線用于判斷miR-331-5p在急性HIV感染診斷中的靈敏度和準確度。所用統(tǒng)計軟件為SPSS 20.0，當P小于0.05時， 認為差異顯著。
[0072] 6.實驗結(jié)果
[0073] (1)標準曲線見圖1。
[0074] 如圖1所示，與內(nèi)參U6水平（圖1左）相比的血漿mi R-3 31 -5p歸一化水平（圖1右)在 HIV感染前后具有顯著差異(P〈0.001)。
[0075] (2)miR-331-5p在急性HIV感染前后的表達水平比較。
[0076] 如圖2所示，20例樣本HIV感染前后血漿miR-331-5p的均值和標準差分別為1.000 ±0.561和2.986± 1.321，急性HIV感染后miR-331-5p的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學 意義(Ρ〈0·001)。
[0077] (3)血衆(zhòng)miR-331-5p對于急性HIV感染的預測值
[0078] 如圖3所示，血漿miR-331-5p作為生物標志物對急性HIV感染的預測表現(xiàn)參見R0C 曲線。20例樣本血漿miR-33l-5p預測急性HIV感染的AUC是0.941 (95 %置信區(qū)間：0.867-1.00)，敏感度和準確度均為90%，說明本發(fā)明檢測結(jié)果準確性高。
[0079] 7.結(jié)論
[0080] (1)急性HIV感染后血衆(zhòng)miR-331-5p水平顯著升高。
[0081 ] (2)血衆(zhòng)miR-331-5p的水平可以作為生物標志物來篩查和診斷急性HIV感染。
[0082]實施例2本發(fā)明試劑盒的制備及使用方法 [0083]本發(fā)明試劑盒的組成：
[0084] 1.用于檢測miR-331-5p表達水平的引物序列，檢測引物序列如上游引物SEQ ID Νο·3(10μΜ)1μL及下游引物SEQ ID Νο·4(10μΜ)1μL所示。
[0085] 2 . PCR反應液可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知組成，本發(fā)明推薦組成為：PCR反應液 12.5yL，其中含Syber green I熒光染料0.5_1X、DNA聚合酶 100U/mL、dNTPs 0.2mM、三羥甲 基氨基甲烷鹽酸鹽16.5mM、氯化鉀89.3mM、氯化鎂6mM和無菌水5.5yL。
[0086] 本發(fā)明試劑盒使用方法：
[0087] 1 ·待檢樣本中miRNA的提?。嘿徺IQiagen的miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒按 照試劑盒說明書操作步驟進行。參照實施例1材料與標本收集描述中血衆(zhòng)miRNA提取。采集 待測者血漿樣本，提取miRNA。
[0088] 2.RT-PCR 擴增
[0089] 采用試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄引物(SEQ ID No.2)對上述miRNA提取物進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 取5yL cDNA為模板進行PCR反應。
[0090] PCR反應體系如下：模板DNA 5yL，PCR反應液12.5yL，上游引物（SEQ ID Νο.3)(10μ M)lyL，下游引物（SEQ ID Νο·4)(10μΜ)1μL，無菌水5.5yL。
[0091] 反應條件為:37°C-20分鐘，95°C-10分鐘；（95°C15秒，60°C1分鐘)-40個循環(huán)。 [0092]內(nèi)參基因 U6的RT-PCR擴增，除引物采用相對應的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測引物外，方法 相同。內(nèi)參基因 U6逆轉(zhuǎn)錄引物如SEQ ID No.5所示，檢測引物如SEQ ID No.6及SEQ ID No.7 所示。
[0093] 3.制作標準曲線:上述檢測完成后，拷貝數(shù)以10為底取對數(shù)作為橫坐標，Cq值作為 縱坐標作圖，繪制標準曲線，計算斜率S，根據(jù)公式E = 10(-1/S)_l，計算擴增效率E。
[0094] 4.計算:選中樣本和校對樣本檢測孔，應用實時定量PCR儀的隨機軟件得出樣本閾 值Cq和校對樣本閾值Cq，根據(jù)公式Q = (E+1) - Δ Cq，Δ Cq = [ Cq⑴-Cq (C)]，得出基因的校正 起始拷貝數(shù)Q，將miR-331-5p的Q值，與內(nèi)參基因 U6的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到miR-331-5p的相對表達量。
[0095] 5.檢測結(jié)果
[0096] (1)若待測患者的miR-331-5p的表達量高于健康人，且二者有顯著差異，則被測者 為或候選為急性HIV感染患者；
[0097] (2)若被測者不滿足上述步驟1)的條件，則被測者不為或候選不為急性HIV感染患 者。
【主權(quán)項】
1. 檢測血衆(zhòng)miR-331-5p表達水平的物質(zhì)在制備診斷或輔助診斷急性HIV感染患者產(chǎn)品 中的用途，其特征在于，所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。2. 檢測miR-331-5p表達水平的物質(zhì)在制備檢測或輔助檢測急性HIV感染的產(chǎn)品中的用 途，其特征在于，所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。3. 如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述檢測miR-331-5p表達水平的物質(zhì)為 如下a)或b)或c): a) 擴增所述miR-331-5p的引物和/或探針； b) 含有所述a)的PCR試劑組； c) 含有所述a)或所述b)的試劑盒。4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述引物包括序列如SEQ ID No.3所示的上 游引物，及序列如SEQ ID No.4所示的下游引物。 5. miR-331-5p作為標志物在制備診斷或輔助診斷急性HIV感染患者產(chǎn)品中的用途，其 特征在于，所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。6. -種檢測miR-331-5p表達水平的物質(zhì)，其特征在于，所述miR-331-5p核苷酸序列如 SEQ ID No.l所示;所述檢測miR-331-5p表達水平的物質(zhì)為如下a)或b)或c): a) 擴增所述miR-331-5p的引物和/或探針； b) 含有所述a)的PCR試劑組； c) 含有所述a)或所述b)的試劑盒。7. 權(quán)利要求6述的檢測miR-331-5p表達水平的物質(zhì)，其特征在于，所述擴增miR-331-5p 的引物包括序列如SEQ ID No.3所示的上游引物，及序列如SEQ ID No.4所示的下游引物。8. -種檢測或輔助檢測急性HIV感染的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求 6或7所述的檢測miR-331-5p表達水平的物質(zhì)。9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒組成為:權(quán)利要求7所述的引物 及PCR反應液。10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液12.5yL，其由Syber green I熒光染料〇.5_1X、DNA聚合酶100U/mL、dNTPs 0.2mM、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽16.5mM、氯 化鉀89.3mM、氯化鎂6mM和水組成。
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測miR-331-5p表達水平的物質(zhì)在制備診斷或輔助診斷急性HIV感染患者產(chǎn)品中的用途，所述miR-331-5p核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。本發(fā)明利用實時定量PCR技術(shù)，待測樣品為待測者血漿，通過檢測被測血漿中miR-331-5p的含量，并通過與正常人群miR-331-5p水平比較以診斷急性HIV感染。本發(fā)明提出的急性HIV感染標志物miR-331-5p預測急性HIV感染的AUC是0.801(95％置信區(qū)間：0.65-0.95)，敏感度和準確度均為80％。靈敏性高，特異性強，操作方便，有利于臨床應用。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105567838
【申請?zhí)枴緾N201610075892
【發(fā)明人】張宏偉, 吳昊, 張彤, 張美 , 李珍, 陸小凡, 夏煒, 張欣
【申請人】首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年2月2日