用于凈化高密度粗細胞培養(yǎng)收獲物的方法
【專利說明】用于凈化高密度粗細胞培養(yǎng)收獲物的方法
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)純化領(lǐng)域。更具體地說，它涉及用于凈化具有高細胞密度的 粗細胞培養(yǎng)收獲物的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在生產(chǎn)生物物質(zhì)，如生物藥品、疫苗和抗體的領(lǐng)域中的最新發(fā)展已經(jīng)針對大規(guī)模 生產(chǎn)產(chǎn)生了需要。需要穩(wěn)固和高產(chǎn)方法以支持全球擁有足量的生物物質(zhì)，以對抗各種疾病。
[0004] 出于該原因，巨大的努力正在被投入優(yōu)化用于生產(chǎn)生物物質(zhì)的基于細胞的方法。 在所述方法中，細胞以漸增的密度被培養(yǎng)，以獲得更高的產(chǎn)物產(chǎn)量/體積。此類高細胞密度 方法被披露于例如TO 2004099396、TO 2005095578或TO 2008006494中。將其內(nèi)容通過引用 結(jié)合在此。
[0005] W0 2008006494披露了用于在生物反應器中培養(yǎng)生產(chǎn)生物物質(zhì)的細胞的方法，其 中該細胞培養(yǎng)是經(jīng)過分離系統(tǒng)來循環(huán)的。所述分離系統(tǒng)從具有比生物物質(zhì)更低分子量的物 質(zhì)中分離出細胞和生物物質(zhì)。這些細胞和生物物質(zhì)在反應器中仍保留在一起，并且沒有彼 此分離。
[0006] W0 2005095578披露了用于在生物反應器中培養(yǎng)產(chǎn)生生物物質(zhì)的細胞的方法，其 中該細胞培養(yǎng)物經(jīng)濾器模塊來進行循環(huán)，導致具有比細胞培養(yǎng)物更低細胞密度并且包括生 物物質(zhì)的液體的流出物。在流出物中細胞和生物物質(zhì)的濃度基本上比在生物反應器中的更 低，因為在23天期間內(nèi)灌注速率范圍在1和13,7L/天之間。（即，處理體積比生物反應器的體 積高20倍）。
[0007] 所述優(yōu)化的細胞培養(yǎng)方法依賴于在保持高生產(chǎn)力/細胞的情況下以高細胞密度 (即，高于ΙΟχΙΟ6個細胞/ml)培養(yǎng)細胞的能力。因此，它們提供了在單生物反應器中獲得具 有高濃度蛋白（即，抗體)的收獲的溶液的方法。
[0008] 以高密度培養(yǎng)細胞的方法傾向于積累大量的細胞碎片及其他雜質(zhì)。純化方法再往 下必須將這些與細胞在一起的污染物丟棄，這是一個麻煩的操作。作為第一步驟，將固體物 料如細胞和細胞碎片從細胞培養(yǎng)液中分離，該步驟稱為凈化。迄今使用的凈化方法的實例 包括離心、過濾(如微濾、深層過濾和通過絕對孔徑膜過濾)和膨脹床層析。
[0009] 更早時期已經(jīng)描述了用于純化生物物質(zhì)如抗體的許多方法，例如，在范里斯(van Reis)等人，（生物技術(shù)與生物工程(Biotechnology and bioengineering)，1991，第38卷， 第413-422頁）中。所述參考文獻描述了一種方法，該方法包括從發(fā)酵罐中回收細胞培養(yǎng)液 并且通過切向流過濾進行細胞-蛋白分離的步驟。然而，所述方法僅在包括約0.5-4xl0 6個 細胞/mL的低密度細胞培養(yǎng)物的情況下進行。迄今沒有披露也沒有預期此類方法可以應用 于包含高細胞密度的培養(yǎng)物。相反，可以從現(xiàn)有技術(shù)推斷一個強有力的建議，即可以不將所 述方法應用于包含高細胞密度的培養(yǎng)物上。例如，在涉及病毒生產(chǎn)領(lǐng)域的W0 2011/045381 中，已經(jīng)嘗試直接凈化具有高細胞密度的細胞培養(yǎng)物(參見W0 2011/045381的實例1)。在所 述嘗試過程中，由于濾器的快速堵塞，不能實現(xiàn)適當?shù)膬艋?。顯然，處理的培養(yǎng)液的高細胞 密度妨礙了純化步驟并且使得切向流過濾(TFF)不適用于直接凈化。僅在用曲通(Triton) (用于溶解細胞)隨后用度米芬(DB)處理高細胞密度培養(yǎng)液后，該細胞培養(yǎng)液可以被進一步 處理(通過凈化）。在收獲后，并不直接通過TFF處理粗細胞培養(yǎng)物。
[0010] 基于這些結(jié)果，不會鼓勵技術(shù)人員在凈化濾器上直接(不用預處理)處理高細胞密 度收獲物，預期它會迅速阻塞。
[0011]當前正在使用并且被認為是處理高細胞密度培養(yǎng)物的當今技術(shù)水平的方法是例 如在W0 2010/043700中或在西爾莫（Schirmer)等人（國際生物過程雜志（Bioprocess International )，2010年1月，第32-39頁）中所描述的。后者參考文獻涉及一種方法，其中首 先將收獲物稀釋，隨后與Si-PEI小球混合，此后小球沉積并且將上清液通過深層過濾去除 并過濾。
[0012] 這種方法的缺點是，根據(jù)在收獲物中的細胞濃度，首先將收獲物稀釋3-5倍，這意 味著也將抗體滴度稀釋3-5倍。其次，在該方法中大量使用的層析樹脂是非常昂貴的并且不 能重復使用。最后，從我們自己的經(jīng)驗與這項技術(shù)，我們已經(jīng)看到回收是可變的。
[0013] 由于細胞培養(yǎng)方法在擴大規(guī)模，并且細胞在以漸增的密度被培養(yǎng)，因此在工業(yè)中 需要下游純化方法，這些下游純化方法與由其他人所描述的方法相比，使得能夠處理高細 胞密度懸浮液，優(yōu)選地具有低成本、高可靠性以及增加的簡易性。這尤其適用于重組蛋白和 抗體生產(chǎn)領(lǐng)域。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 我們在此已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在沒有初步稀釋的情況下，可以將包含高細胞密度的粗細胞培 養(yǎng)收獲物連同分泌性蛋白在TFF裝置上處理。盡管所述粗細胞培養(yǎng)收獲物是非常濃稠的，并 且包含高負荷的細胞碎片，但是它們被成功地凈化并且沒有觀察到壓力增加導致濾器的阻 塞。
[0016] 此外，根據(jù)本發(fā)明的方法比迄今使用的方法更快速并更廉價。不再需要昂貴的層 析樹脂和長時間的沉積步驟，并且該方法容易按比例擴大規(guī)模。
[0017] 因此，本發(fā)明涉及用于凈化粗細胞培養(yǎng)收獲物的方法，該粗細胞培養(yǎng)收獲物包括 細胞連同分泌的所希望的蛋白，其中這些細胞在收獲時處于至少15xl0 6個細胞/ml的細胞 密度，并且其中至少20%的所述細胞是有活力的，所述方法包括如下步驟：
[0018] a.在生物反應器中培養(yǎng)細胞到至少15xl06個細胞/ml的細胞密度，以便獲得包括 所希望的分泌性蛋白的粗細胞培養(yǎng)收獲物，
[0019] b.隨后通過切向流過濾(TFF)處理在步驟a)中獲得的基本上完整的粗細胞培養(yǎng)收 獲物，其中所述粗細胞培養(yǎng)收獲物的處理體積是該生物反應器體積的小于兩倍，在該生物 反應器中已經(jīng)產(chǎn)生粗細胞培養(yǎng)收獲物，并且其中將這種所希望的蛋白從粗細胞培養(yǎng)液中分 尚；并且
[0020] c.回收在濾液中的這種所希望的蛋白。
[0021] 在一個優(yōu)選的實施例中，在沒有預先稀釋在步驟a)中獲得的細胞培養(yǎng)液的情況 下，使在步驟b)中的細胞培養(yǎng)液經(jīng)受TFF。
[0022] 在一些優(yōu)選的實施例中，所述細胞在收獲時處于至少50xl06個細胞/ml的細胞密 度。在其他優(yōu)選的實施例中，所述細胞在收獲時處于范圍在至少50xl0 6個細胞/ml和200xl06 個細胞/ml之間的細胞密度。
[0023] 在其他優(yōu)選的實施例中，這種所希望的蛋白是一種單克隆抗體。在另一個優(yōu)選的 實施例中，將在步驟b中回收的所希望的蛋白進一步純化。
[0024]在其他優(yōu)選的實施例中，用中空纖維濾器進行TFF。所述中空纖維濾器優(yōu)選地包括 范圍在750Kda和0 · 65μπι之間的孔徑。
[0025]在其他優(yōu)選的實施例中，在TFF裝置中的中空纖維濾器包括范圍在0.25和1mm之間 的內(nèi)腔直徑。
[0026] 附圖簡要說明 [0027]圖1實驗裝置
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 本發(fā)明涉及用于凈化包含細胞連同分泌性蛋白的細胞培養(yǎng)液的方法，該細胞培養(yǎng) 液包括高細胞密度。在本文的上下文中"粗細胞培養(yǎng)收獲物"、"收獲物"或"細胞培養(yǎng)液 (cell broth)"意指用完整的細胞接種的細胞培養(yǎng)物，并且其進一步可以包括如下定義的 培養(yǎng)基、連同分泌性蛋白。優(yōu)選的，這些細胞是分泌蛋白的細胞。
[0030] "凈化"意指從細胞培養(yǎng)液中分離固體材料如細胞和細胞碎片。根據(jù)本發(fā)明，分泌 性蛋白是存在于細胞外的，并且因此將存在于細胞培養(yǎng)液中。在本發(fā)明中，"凈化"意指從包 含細胞的粗細胞培養(yǎng)收獲物中分離分泌性蛋白。
[0031] 在本發(fā)明的方法中，尤其當細胞密度極高的時候，來自生物反應器的起始材料被 任選地稀釋至優(yōu)選的細胞密度。然而，根據(jù)本發(fā)明的所述粗細胞培養(yǎng)收獲物的處理體積并 沒有超過生物反應器體積的兩倍，在該生物反應器中已經(jīng)產(chǎn)生該粗細胞培養(yǎng)收獲物。出于 本發(fā)明的目的，這樣稀釋的材料仍然由術(shù)語粗細胞培養(yǎng)收獲物或細胞培養(yǎng)液所涵蓋。優(yōu)選 地，在沒有預先稀釋粗細胞培養(yǎng)收獲物的情況下，使粗細胞培養(yǎng)收獲物或細胞培養(yǎng)液經(jīng)受 TFF〇
[0032] 此外，根據(jù)本發(fā)明，它是在步驟a)中獲得的基本上完整粗細胞培養(yǎng)收獲物或細胞 培養(yǎng)液，其隨后由TFF進行處理。"基本上完整的粗細胞培養(yǎng)收獲物"意指至少70%的完整粗 細胞培養(yǎng)收獲物，優(yōu)選地它意指至少80 %的完整粗細胞培養(yǎng)收獲物，更優(yōu)選至少90 %的完 整粗細胞培養(yǎng)收獲物并且甚至更優(yōu)選至少95 %的完整粗細胞培養(yǎng)收獲物。
[0033] "分泌性蛋白"在此意指當其由細胞產(chǎn)生時，主要釋放(主動地或被動地)到培養(yǎng)基 中的蛋白。"所希望的"在此意指，蛋白是使用細胞有意生產(chǎn)的。
[0034]除非另有說明，在本申請中使用的"約"意指±10%。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明方法凈化的粗細胞培養(yǎng)收獲物或細胞培養(yǎng)液可以通過任何細胞培養(yǎng) 方法來獲得，該細胞培養(yǎng)方法適用于獲得至少15xl0 6個細胞/ml的哺乳動物細胞的細胞密 度。在這方面適合的方法描述于例如WO 2005095578、W0 2004099396和W0 20