08006494中。 將其內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。根據(jù)本發(fā)明，通過培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞至高細(xì)胞密度來獲得高 細(xì)胞密度懸浮液。這種培養(yǎng)可以按(非限制)分批、補(bǔ)料分批或灌注模式進(jìn)行。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述粗細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中的細(xì)胞密度是至少約 15x 106個(gè)細(xì)胞/mL、例如至少約20x 106個(gè)細(xì)胞/mL、例如至少約25x 106個(gè)細(xì)胞/mL、例如至少約 30xl06個(gè)細(xì)胞/mL、例如至少約40xl0 6個(gè)細(xì)胞/mL、例如至少約50xl06個(gè)細(xì)胞/mL。
[0037] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述粗細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中的細(xì)胞密度是例如， 高達(dá)約150xl06個(gè)細(xì)胞/mL、例如，高達(dá)約200xl0 6個(gè)細(xì)胞/mL、例如，高達(dá)約250xl06個(gè)細(xì)胞/ mL、例如，高達(dá)約300x106個(gè)細(xì)胞/mL。
[0038] 根據(jù)發(fā)明，凈化的細(xì)胞培養(yǎng)液包括范圍在ΙΟχΙΟ6和300xl06個(gè)細(xì)胞/mL之間，例如在 約15xl06和250xl06個(gè)細(xì)胞/mL之間、例如在約30xl06和200xl0 6個(gè)細(xì)胞/mL之間、例如在約 50xl06和150xl06個(gè)細(xì)胞/mL之間、例如在約70xl06和130xl0 6個(gè)細(xì)胞/mL之間、例如在約 90xl06和ΙΙΟχΙΟ6個(gè)細(xì)胞/mL之間的細(xì)胞密度。
[0039] 可以使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器如Vi-CELL?來測量細(xì)胞密度，該Vi-CELL?使用了臺(tái)盼藍(lán)拒 染法。其他適用的方法包括細(xì)胞計(jì)量術(shù)、細(xì)胞壓積確定、或使用了電感帶法的庫爾特計(jì)數(shù) 器。
[0040] 此外，在本發(fā)明中，在凈化之前細(xì)胞培養(yǎng)的活力保持高于20%。這意味著在培養(yǎng)物 中總量細(xì)胞的至少20%在凈化方法開始時(shí)是有活力的。在某些實(shí)施例中，在凈化方法開始 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)物的活力是至少40 %，在另外的實(shí)施例中是至少60 %，在另外的實(shí)施例中是至 少80%，在另外的實(shí)施例中是至少90%?；盍梢允褂眉夹g(shù)人員可以使用的常規(guī)方法來測 量，例如，臺(tái)盼藍(lán)拒染法、卡西細(xì)胞計(jì)數(shù)(Casy cell count)、等。
[0041] "培養(yǎng)基"在此意指細(xì)胞的胞外環(huán)境，該胞外環(huán)境包含營養(yǎng)素和其他支持細(xì)胞生長 和生產(chǎn)的成分，但是還可包含廢物和/或宿主細(xì)胞蛋白（HCP)和/或來自裂解細(xì)胞的材料。培 養(yǎng)基的組成在細(xì)胞的培養(yǎng)歷程期間會(huì)適時(shí)地有所不同，并且在凈化階段會(huì)耗盡一種或多種 原始成分。
[0042] 一旦蛋白質(zhì)已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中分泌，那么根據(jù)本發(fā)明，可以將所述蛋白質(zhì)從高 細(xì)胞密度懸浮液或粗細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中純化。對所希望的蛋白進(jìn)行這種純化的第一步驟為 凈化粗細(xì)胞培養(yǎng)收獲物。
[0043]
[0044] 隨后，將從之前培養(yǎng)步驟獲得的粗細(xì)胞培養(yǎng)收獲物凈化，來去除沉淀雜質(zhì)和細(xì)胞 碎片。根據(jù)本發(fā)明，所述凈化是用TFF裝置進(jìn)行的。所述TFF裝置優(yōu)選包括中空纖維(參見圖 1)。可替代地，TFF裝置包括盒式濾器。在凈化過程中，將分泌性蛋白用切向流過濾裝置從粗 細(xì)胞培養(yǎng)收獲物中分離。分泌性蛋白典型地通過過濾裝置切線過濾，并且在濾液中回收。切 向流過濾是本發(fā)明的凈化的穩(wěn)固方法。
[0045]總的來說，所有類型的中空纖維濾器都可以用于本申請。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中， 這些中空纖維是常用的來自WaterSep的Discover、Explorer、Investigator以及 BioProducer濾器。也同樣適用于本方法的其他濾器是來自仕必純實(shí)驗(yàn)室(Spectrum Labs) 的MidiKros、MiniKros、KrosFlo和CellFlo濾器。通用醫(yī)療(GEHealthcare)也以PS(聚諷） 制作了各式各樣的中空纖維濾器。用于中空纖維濾器的優(yōu)選材料是聚醚砜（PES)、聚砜 (PS)、改性的聚醚砜(m-PES)、混合的纖維素酯(ME)或陶瓷濾器。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明，這些濾器可以具有不同的孔徑。根據(jù)本發(fā)明，這些中空纖維包括范圍 在250kDa和5μηι之間，例如在約400kDa和4μηι之間、例如在約500kDa和2 · 5μηι之間、例如在約 600kDa和Ιμπι之間的孔徑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該孔徑范圍在750kDa和0 · 65μπι之間。
[0047] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該中空纖維濾器包括范圍在0.1和6.0mm之間、例如在 0.2和5_之間、例如在0.2和3_之間、例如在0.2和2_之間的內(nèi)腔直徑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 例中，該內(nèi)腔直徑范圍在0.25和1mm之間。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施例中，該內(nèi)腔直徑約為 0.5mm〇
[0048] 本發(fā)明的凈化方法從細(xì)胞培養(yǎng)液去除至少70%、更可能至少80%、或甚至優(yōu)選至 少90%的全細(xì)胞和細(xì)胞碎片，而遠(yuǎn)離包含所希望的蛋白的懸液液。
[0049] 在通過切向流過濾凈化粗細(xì)胞培養(yǎng)收獲物之后，回收所希望的蛋白。"回收"在此 意指獲得本質(zhì)上不含細(xì)胞和細(xì)胞碎片的所希望的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，在TFF裝置的濾液中回 收所希望的蛋白。細(xì)胞碎片以及其他雜質(zhì)仍保留在滯留物中。
[0050] 進(jìn)一步純化方法
[0051] 為了進(jìn)一步純化獲得自以上描述步驟的包括所希望蛋白的懸浮液，技術(shù)人員了解 并可以在若干純化步驟之間進(jìn)行選擇。它們包括，例如，過濾（如深層過濾、微濾、超濾、滲 濾）、層析(如尺寸排阻層析、親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、疏水作用層析、 固相金屬親和層析）、雙水相萃取、沉淀或離心。舒卡(Shulka)等人，2007和凱利(Kelly)等 人，2009提供了在本領(lǐng)域中常用的進(jìn)一步純化步驟的綜述，特別是針對抗體純化。
[0052]在免疫球蛋白作為所希望的蛋白的情況下：親和層析、特別是蛋白A層析、以及陽 離子交換層析是特別合適的分離方法。
[0053] 在根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例中，可以將包含所希望蛋白的凈化懸浮液通過超濾進(jìn) 行處理。超濾被用來濃縮包含所希望蛋白的懸浮液?？梢詫⒃搼腋∫簼饪s5至20倍。
[0054] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)過滲濾進(jìn)行緩沖液交換。使用超濾器的滲濾、或緩 沖液交換是一種用于去除并交換鹽、糖以及類似物的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知緩沖液交 換應(yīng)該發(fā)生在哪種條件下并且哪種緩沖液適用于該步驟。
[0055] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，以下步驟可以是陰離子交換層析步驟。在所述步驟 過程中，蛋白質(zhì)結(jié)合至帶正電的材料上，例如膜、管筒或柱。隨后的洗脫允許將蛋白與雜質(zhì) 分離并且保留宿主細(xì)胞DNA。在又另一個(gè)實(shí)施例中，可以將陰離子交換層析步驟用作一種流 經(jīng)系統(tǒng)。
[0056] 在某些實(shí)施例中，優(yōu)選使用至少一種陰離子交換層析步驟。在陰離子交換層析步 驟之后，這些蛋白可以是足夠純的。然而，在某些實(shí)施例中，進(jìn)一步進(jìn)行尺寸排阻層析步驟 以增加該方法的穩(wěn)固性。該步驟可以是在陰離子交換層析步驟之前或之后。
[0057] 在本發(fā)明的任何具體實(shí)施例中，該陰離子交換產(chǎn)物可以滲濾到配制品緩沖液中并 且進(jìn)行無菌過濾?？商娲兀硗獾膶游霾襟E(例如，陽離子交換)可以在具有改進(jìn)雜質(zhì)和/ 或病毒/朊病毒清除的穩(wěn)固性的潛力的滲濾之前或之后添加。
[0058]無菌過濾步驟可以包含在該方法中，有助于消除生物負(fù)載?？梢詫a(chǎn)物通過0.22 微米改性聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(例如密理博(Millipore)Millipak)過濾。
[0059] 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及下游處理系統(tǒng)的規(guī)模
[0060] 本發(fā)明的這些方法是比例可調(diào)的。本發(fā)明中使用的細(xì)胞培養(yǎng)范圍為從小規(guī)模培養(yǎng) (例如，1-10升流量)至中規(guī)模培養(yǎng)(例如，10-1000L流量)乃至大型商業(yè)規(guī)模的制備，如1000 至10 000L生產(chǎn)流量。切向流過濾步驟規(guī)模隨培養(yǎng)體積改變規(guī)模，而任選的和隨后的步驟如 陰離子交換層析隨所希望蛋白的輸入改變規(guī)模。因此，后者步驟的大小將基于生物反應(yīng)器 生產(chǎn)力估計(jì)量。
[0061] 本發(fā)明使得從高密度粗細(xì)胞培養(yǎng)收獲物(其可包含高濃度蛋白）中純化蛋白變成 可能。處理這些細(xì)胞懸浮液(其包含大量的細(xì)胞碎片和宿主細(xì)胞DNA)的可能性允許純化大 量蛋白質(zhì)如抗體/體積的懸浮液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)提供了用于處理具有高細(xì)胞密度的細(xì)胞培 養(yǎng)批次的方法，這些細(xì)胞培養(yǎng)批次包含高濃度的所希望的蛋白，并且于此允許非常高的產(chǎn) 量/處理體積。盡管本方法適用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，但是該方法也允許以較小規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞 至較高細(xì)胞密度，并且仍然達(dá)到高產(chǎn)物產(chǎn)量，這些產(chǎn)物可以有效地被進(jìn)一步處理。該方法提 供了處理所希望蛋白的高度濃縮批次的可能性，該方法將對整個(gè)生物醫(yī)藥純化產(chǎn)業(yè)具有很 大的影響。
[0062] |m
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可以是任何類型的細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CH0(中國倉鼠卵 巢)細(xì)胞，雜交瘤，BHK (幼侖鼠腎）細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞，人類細(xì)胞，例如HEK-293細(xì)胞，人類類淋 巴母細(xì)胞，PER. C6細(xì)胞，小鼠細(xì)胞，例如NS0細(xì)胞，MDCK細(xì)胞，Vero細(xì)胞，羊水細(xì)胞，鴨細(xì)胞系， 等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在本發(fā)明的方法中的這些細(xì)胞是分泌蛋白的細(xì)胞。
[0064]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在本發(fā)明的方法中的這些細(xì)胞是PER.C6細(xì)胞或其衍生 物(參見美國專利5,994，128和美國專利7,291，484，將其內(nèi)容通過引用結(jié)合在此）<^1^6 細(xì)胞由以ECACC號(hào)96022940保藏的細(xì)胞進(jìn)行示例。
[0065] 分泌性蛋白
[0066] 可以由根據(jù)本發(fā)明細(xì)