30分 鐘。采用紫外檢測器210nm選擇吸收波長，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為100mL/針，流動(dòng)相流 速為600mL/min，收集15. 5-17分鐘（8號(hào)峰）的組分，如圖1所示。進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 干，得一維液相組分。
[0043] -維液相組分使用正己烷體積分?jǐn)?shù)為70 %的正己烷-乙醇二元混合溶劑復(fù)溶，溶 解至濃度為100mg/mL，用于二維液相色譜分離。
[0044] 二維色譜分離采用X-Amide20X250mm，10 μπι，〗棚、A，流動(dòng)相采用有機(jī)相的混合， 其中有機(jī)相Α相是正己烷，Β相是乙醇，梯度洗脫方式：Β相濃度0-30%梯度洗脫30分鐘， 采用紫外檢測器210nm選擇吸收波長，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為lmL/針，流動(dòng)相流速為 14mL/min，收集17-18分鐘（3號(hào)峰）的組分，如圖2所示。進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干得到白 色晶體狀目的組分，稱重為〇. 724g，計(jì)算產(chǎn)率為0. 0181 %。
[0045] 實(shí)施例2 :
[0046] 將實(shí)施例1得到的目的組分利用分析型色譜柱進(jìn)行純度檢驗(yàn)，如圖3所示，純度達(dá) 到99%，為單體化合物。色譜柱選用正相硅膠色譜柱Silica 4. 6 X 250mm，10 μ m，100 A。
[0047] 將目的單體化合物進(jìn)行核磁共振分析（Bruker A. G AVIII600PLUS，瀚盟生物技術(shù) (天津）有限公司），核磁圖譜如圖4、5所示，根據(jù)1H NMR、13C NMR譜圖得出的該單體化合 物的NMR數(shù)據(jù)，如表1所示。
[0048] 表 1 :1H NMR(600MHz)和 13C NMR(600MHz) (CDC13, TMS, ppm)
[0049]

[0050] 對(duì)得到的核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，得出該單體化合物的結(jié)構(gòu)式為：
[0051]
[0052] 該單體化合物分子式為C15H2(]03，分子量為248。經(jīng)系統(tǒng)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)該單體化 合物為一未見報(bào)道的新化合物，化合物母核為吉馬烷型骨架結(jié)構(gòu)，我們將其命名為8-羥 基-吉馬-1，7-二烯-5酮-8, 12-內(nèi)酯，屬酮類化合物。
[0053] 實(shí)施例3 :人肝癌細(xì)胞Η印一G2實(shí)驗(yàn)
[0054] 將艾森生物（杭州）有限公司生產(chǎn)的八孔板（E-Plate L8)與iCELLigence實(shí)時(shí) 無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀組合，向每孔中加入150ul F-12K培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02的培 養(yǎng)箱中，將背景數(shù)據(jù)調(diào)至40-130之間。將實(shí)施例1分離得到的化合物樣品（EZ-8-3)用二 甲基亞砜完全溶解至50mg/ml，再用F-12K培養(yǎng)基將其稀釋成5mg/ml工作液，將培養(yǎng)好的 人肝癌細(xì)胞Hep-G2用胰酶消化，并稀釋成4 X 104/ml的活細(xì)胞懸液，接種于八孔板中，每孔 345ul，加入工作液5ul，使其終濃度為50 μ g/ml，對(duì)照孔（DMS0)則加入5ull%。二甲基亞砜 的F-12K培養(yǎng)基，置于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)。結(jié)果顯示，目的單體化合物 8-羥基-吉馬-1，7-二烯-5酮-8, 12-內(nèi)酯在第2個(gè)小時(shí)以后明顯抑制了肝癌細(xì)胞的繁 殖，相比于空白實(shí)驗(yàn)組DMS0對(duì)肝癌細(xì)胞Η印-G2有較強(qiáng)的抗癌活性，如圖6所示。
[0055] 實(shí)施例4 :人肺癌細(xì)胞Α549實(shí)驗(yàn)
[0056] 將艾森生物（杭州）有限公司生產(chǎn)的八孔板（E-Plate L8)與iCELLigence實(shí)時(shí) 無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀組合，向每孔中加入150ul MEM培養(yǎng)基，置于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱 中，將背景數(shù)據(jù)調(diào)至40-130之間。將實(shí)施例1分離得到的化合物樣品（EZ-8-3)用二甲基 亞砜完全溶解至50mg/ml，再用MEM培養(yǎng)基將其稀釋成5mg/ml工作液，將培養(yǎng)好的人肺癌細(xì) 胞A549用胰酶消化，并稀釋成2 X 104/ml的活細(xì)胞懸液，接種于八孔板中，每孔345ul，加入 工作液5ul，使其終濃度為50 μ g/ml，對(duì)照孔（DMS0)則加入5ul 1 %。二甲基亞砜的MEM培 養(yǎng)基，置于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，目的單體化合物 8-羥基-吉馬-1，7-二烯-5酮-8, 12-內(nèi)酯對(duì)肺癌細(xì)胞A549在第5個(gè)小時(shí)以后有明顯的 抑制作用，相比于空白實(shí)驗(yàn)組DMS0有較強(qiáng)的抗癌活性。
[0057] 由實(shí)施例3、4可知，本發(fā)明所得目的單體化合物8-羥基-吉馬-1，7-二烯-5 酮-8, 12-內(nèi)酯具有較強(qiáng)的抑制肺癌A549細(xì)胞和肝癌Η印-g2細(xì)胞的活性，接下來我們將進(jìn) 一步進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物藥效學(xué)、藥理學(xué)、急性毒性、長期毒性試驗(yàn)，力圖開發(fā)出強(qiáng)活性抗腫瘤單 體藥物，為人類的健康奉獻(xiàn)微薄力量。
[0058] 本發(fā)明實(shí)施例涉及到的材料、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備，如無特別說明，均為符合中藥提取 的市售產(chǎn)品。
[0059] 以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)的前提下，還可以做出改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 屬于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都 應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新化合物，其特征在于該新化合物的結(jié)構(gòu)式為： 2. 權(quán)利要求1所述的新化合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 以莪術(shù)塊莖為原料，磨成粉末狀后用乙醇浸泡或者回流提取，最終所得濾液進(jìn)行旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得粗提物，粗提物溶于正己烷-乙醇二元混合溶劑中，配成濃度為50-500mg/ mL的提取液； (2) 對(duì)提取液進(jìn)行一維液相色譜分離：采用的色譜柱為正相硅膠色譜柱，采用的流動(dòng) 相為A相正己烷、B相乙醇的二元流動(dòng)相，進(jìn)樣量為lOOmL/針，流動(dòng)相流速為600mL/min，洗 脫方式為B相濃度0-50 %梯度洗脫30min，檢測器為紫外檢測器、檢測波長210nm，根據(jù)紫外 吸收光譜收集15. 5-17分鐘洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到一維液相組分； (3) 使用正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解至濃度為100mg/mL ; (4) 進(jìn)行二維液相色譜分離：采用的色譜柱為Acchrom X-Amide色譜柱，采用的流動(dòng)相 為A相正己烷、B相乙醇的二元流動(dòng)相，進(jìn)樣量為lmL/針，流動(dòng)相流速為14mL/min，洗脫方 式為B相濃度0-30 %梯度洗脫30min，檢測器為紫外檢測器、檢測波長210nm，根據(jù)紫外吸收 光譜收集17-18分鐘洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到目的產(chǎn)物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的新化合物的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)、（3)中正 己烷-乙醇二元混合溶劑中正己烷體積分?jǐn)?shù)為70 %。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的新化合物的制備方法，其特征在于：所述步驟（2)中正相硅 膠色譜柱的尺寸為直徑150_、長度250_，其中填料粒徑為10 μ m，使用時(shí)柱溫為室溫。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的新化合物的制備方法，其特征在于：所述步驟（4)中Acchrom X-Amide色譜柱的尺寸為直徑20mm、長度250mm，其中填料粒徑為10 μ m，使用時(shí)柱溫為室 溫。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新化合物，其分子式C15H20O3，分子量248，中文名稱為8-羥基-吉馬-1,7-二烯-5酮-8,12-內(nèi)酯。制備方法為：以莪術(shù)塊莖為原料，磨成粉末狀后乙醇提取，濾液濃縮后溶于正己烷-乙醇混合溶劑中；一維色譜：采用正相硅膠色譜柱，A相正己烷、B相乙醇二元流動(dòng)相，B相濃度0-50％梯度洗脫，收集15.5-17分鐘洗脫液；正己烷-乙醇混合溶劑溶解；二維色譜：采用Acchrom？X-Amide色譜柱，A相正己烷、B相乙醇二元流動(dòng)相，B相濃度0-30％梯度洗脫，收集17-18分鐘洗脫液，得純度99％目的單體化合物。該新化合物被證明具有抗肝癌、抗肺癌生物活性，可用于制備相關(guān)藥劑。
【IPC分類】C07D307/93, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105601599
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510551878
【發(fā)明人】張耀洲, 韓朝, 蓋其靜, 杜思邈
【申請(qǐng)人】天津耀宇生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月1日