一種新型重組高穩(wěn)定性超氧化物歧化酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥、化妝品和功能食品等領(lǐng)域，具體涉及一種耐消化道酶酶解、 耐酸堿、耐高溫的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，S0D)、其編碼基因和應(yīng)用，以及 包含該耐高溫超氧化物歧化酶的化妝品、保健食品和藥物組合物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自由基是生命科學(xué)的研究熱點，1956年美國的Harman將輻射化學(xué)中的自由基概念 引入生物領(lǐng)域，提出了著名的自由基學(xué)說(Free radial theory)?；钚匝?R0S)是機體內(nèi)最 常見的自由基。人體的自由基以氧自由基為主。機體內(nèi)過多的活性氧會引起脂質(zhì)過氧化，改 變生物膜結(jié)構(gòu)和功能，使蛋白質(zhì)變性、交聯(lián)，酶失活等?；钚匝跖c心肌休克、輻射損傷、動脈 粥樣硬化、免疫系統(tǒng)缺陷等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。過量的自由基誘發(fā)機體氧化反應(yīng)， 可損害機體的組織和細胞，進而導(dǎo)致衰老，于是Harman提出了著名的自由基衰老學(xué)說。氧化 應(yīng)激導(dǎo)致生物分子的氧化損傷，引起機體內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)產(chǎn)生和釋放細 胞因子。細胞因子能激活模式識別受體(PRRs)下游的信號通路，如核因子kB(NF-kB)、JAK、 STAT和MAPK等，導(dǎo)致細胞因子和趨化因子釋放增加，招募和激活更多的炎性細胞，引起機體 系統(tǒng)性慢性炎癥反應(yīng)?；谘趸瘧?yīng)激與炎癥、衰老的密切關(guān)系，De la Fuente等提出了氧 化-炎癥衰老學(xué)說，并認為氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎性衰老。
[0003] 超氧化物歧化酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是機體不可缺少的一種重要的氧自由 基清除劑，在生物體防御氧化損傷方面具有重要的作用。根據(jù)結(jié)合的金屬離子輔基的不同， S0D可分為四大類:Cu/Zn-SOD、Fe-S0D、Mn-S0D和Ni-SOD。研究表明，S0D能有效地清除氧自 由基，可治療多種炎癥、對于輻射損傷的預(yù)防和治療也有重要作用。其中性質(zhì)最為穩(wěn)定，毒 性最小的是Mn-S0D。
[0004] 在線粒體的氧化磷酸化電子傳遞體系中，分子02是最后一個受體，正常情況下02接 受四個電子變?yōu)镠 20,如果部分傳遞電子，則會形成高活性的氧自由基(R0S)，氧自由基會攻 擊脂膜、蛋白質(zhì)、DNA，引起神經(jīng)退化、衰老、癌癥、肺纖維化、血管疾病，R0S還是重要的誘發(fā) 炎癥反應(yīng)的因素。炎癥是機體對感染源、外傷或組織缺血產(chǎn)生的一種防御性的反應(yīng)。不正常 的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致多種疾病。炎癥最重要的共性病理特征是白細胞（中性粒細胞和巨噬細胞） 的迀移、聚集和浸潤，研究中性粒細胞的聚集部位和數(shù)量是研究炎癥最常見的方法。很多實 驗證明過抗氧化酶是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。位于線粒體中的Μη-SOD是去除氧自由基的 第一個酶，它的活性關(guān)系著自由基的清除速率和炎癥的修復(fù)效率。
[0005] 哺乳動物Μη-SOD位于線粒體內(nèi)，它的功能是控制線粒體中(V的水平，避免氧自由 基對線粒體的損傷。對于生物體內(nèi)Μη-SOD的功能的研究證明，Μη-SOD與炎癥反應(yīng)、細胞衰老 密切相關(guān)。缺乏該基因的小鼠多數(shù)器官的線粒體都有嚴重的損傷，該基因敲除后，小鼠往往 在胎兒期死亡，而補充Μη-SOD則能夠使其存活期延長。Μη-SOD可能成為一種新型抗炎癥藥 物。
[0006] 環(huán)境污染、心理壓力大、嗜煙嗜酒等不良的生活習(xí)慣都會導(dǎo)致體內(nèi)代謝的異常，大 量積累氧自由基，導(dǎo)致情緒低落、疲憊、免疫力降低，使人長期處于亞健康狀態(tài)。如果能夠適 量補充SOD，將會改善這些亞健康癥狀，因而SOD可以用于保健品或作為食品添加劑使用。另 外，Mn-SOD還具有抗衰老、防止皮膚色素沉著等作用，因而也可以在化妝品中添加使用。
[0007] 雖然目前的基礎(chǔ)研究已經(jīng)證明了S0D的作用方式及其功效，但是，S0D還很難有實 際的應(yīng)用，也不能達到預(yù)期的治療效果，這主要是由以下因素造成的：首先，由于在藥物制 備、化妝品和食品加工的過程中多涉及到滅菌、加熱提取等步驟，而普通S0D穩(wěn)定性差、不耐 高溫、不耐長時間存儲的特點嚴重制約了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用;其次，S0D是生物大分子，透皮吸收 的量有限，可能限制其療效;最后，口服藥物和食品均由消化道消化吸收，S0D作為一種蛋白 質(zhì)，往往被胃液和腸液中的蛋白酶消化降解，不能起到應(yīng)有的作用。歐洲食品安全評價機構(gòu) (European Food Safety Authority，EFSA)認為S0D對于健康的促進的作用還需要更多的 證據(jù)（EFSA Journal 2010;8(10): 1753)〇
[0008] 盡管，許多研究者也進行了很多的探索，比如通過基因工程方法生產(chǎn)耐高溫的SOD 以期克服上述缺陷，但到目前為止，現(xiàn)有技術(shù)中仍存在如下技術(shù)難題尚未克服:1)重組表達 的S0D存在耐酸堿性不足;2)所產(chǎn)S0D易被消化道中的胃蛋白酶、胰蛋白酶降解而失去活性。
[0009] 因此，現(xiàn)有技術(shù)中的S0D由于在耐高溫、耐酸堿性、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶降解等 方面存在的缺陷，極大地限制了 S0D在化妝品、食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用?，F(xiàn)急需開發(fā)一種 新的同時耐高溫、耐酸堿性、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶等降解的超氧化物歧化酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明通過基因工程手段解決了上述現(xiàn)有技術(shù)的問題，因此本發(fā)明的目的之一是 提供一種新的耐高溫、耐酸堿、耐消化道酶降解的超氧化物歧化酶及其編碼基因和應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明提供一種耐高溫、耐酸堿、耐消化道酶降解的超氧化物歧化酶，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.4所示。
[0012] 本發(fā)明還提供了編碼上述耐高溫、耐酸堿、耐消化道酶降解的超氧化物歧化酶的 基因，優(yōu)選地所述基因序列為序列表中SEQ ID N0.3所示的DNA序列。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供含有上述基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、 宿主囷。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該組合物含有有效治 療量的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示的超氧化物歧化酶。其中，"有效治療量"的意思是指 "本發(fā)明公開的藥物組合物在實現(xiàn)所需結(jié)果或治療結(jié)果需要的劑量和時間周期下有效的 量"。有效治療量可隨本領(lǐng)域中已知的因素而變化，例如待治療的人或動物的疾病狀況、年 齡、性別和重量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，所述劑量方案可改變以提供最佳的治療響應(yīng)。例 如，可每日給予數(shù)個分開的劑量或可就治療情形緊迫所表示的成比例減少劑量。此外，本公 開的組合物可按所需的頻率給予，以實現(xiàn)有效治療量。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供的上述藥物組合物還含有抗菌劑和/或可藥 用載體和/或賦形劑。所述藥物組合物的劑型為內(nèi)服劑型或外用劑型，其中，所述內(nèi)服劑型 優(yōu)選口服液劑、片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、口服散劑等;所述外用劑型優(yōu)選外用散劑、軟膏 劑、貼劑、外用液體劑、栓劑、噴劑、氣霧劑、吸入劑。另外，為了延長蛋白質(zhì)藥物在血液中保 留時間，本發(fā)明還可以采用脂肪酸、多糖類物質(zhì)、月桂酰氯、右旋糖酐、聚乙二醇(PEG)等制 藥領(lǐng)域常用修飾劑對耐高溫SOD進行化學(xué)修飾。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供一種化妝品組合物，其特征在于，所述化妝 品組合物包含有效量的本發(fā)明所述的超氧化物歧化酶。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供一種食品添加劑，所述食品添加劑包含本 發(fā)明所述的超氧化物歧化酶。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示的耐高溫 超氧化物歧化酶的制備方法，所述制備方法具體為通過表達編碼所述耐高溫超氧化物歧化 酶的基因，如序列表中SEQ ID N0.3所示的DNA序列或者通過化學(xué)合成方法獲得所述耐高溫 超氧化物歧化酶。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的超氧化物歧化酶或所述的 基因或所述的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、宿主菌或所述的藥物組合物在制備抗炎藥物中的 應(yīng)用。其中，所述炎癥包括粘膜炎癥、外源性致炎因子（inf lammatory agent)引起的炎癥或 皮膚炎癥。其中，所述粘膜炎癥包括:呼吸道、消化道、生殖器官、聽覺器官、視覺器官粘膜炎 癥，優(yōu)選口腔潰瘍、牙齦炎、腸炎、胃炎、陰道炎、盆腔炎、膀胱炎、宮頸炎、鼻炎、咽炎、中耳 炎、外耳道炎、眼結(jié)膜炎、眼角膜炎;所述外源性致炎因子引起的炎癥包括由生物性因子、物 理性因子、外源性化學(xué)性因子、或前述幾種致炎因子組合引起的炎癥，優(yōu)選地，生物性因子 引起的炎癥包括細菌、病毒、立克次體、原蟲、真菌、螺旋體和寄生蟲作用于機體引起的炎 癥;優(yōu)選地，物理性因子引起的炎癥包括機械力、高溫、低溫、電離輻射、紫外線作用于機體 引起的炎癥，更優(yōu)選燒傷、燙傷、凍傷、曬傷、割傷、輻射損傷引起的炎癥或外科手術(shù)或放療 后形成的炎癥;優(yōu)選地，外源性化學(xué)性因子引起的炎癥包括放射性物質(zhì)、強酸、強堿、強氧化 劑、酒精、化學(xué)藥物作用于機體引起炎癥，更優(yōu)選酒精或藥源性肝炎、化療后形成的炎癥;所 述皮膚炎癥包括手足癬、毛囊炎、接觸性皮炎、濕疹、蕁麻疹、神經(jīng)性皮炎、脂溢性皮炎，優(yōu)選 嬰幼兒濕疹。
[0020] 具體地，生物性因子是引起炎癥最常見的原因，由其引起的炎癥又稱為感染。例 如:細菌可釋放內(nèi)毒素和外毒素激發(fā)炎癥;病毒可通過在細胞內(nèi)復(fù)制，致感染細胞壞死;某 些病原體通過其抗原性誘發(fā)超敏反應(yīng)性炎癥，如結(jié)核病等。其中，物理性因子包括機械力 (如割傷）、高溫(如燒傷、燙傷）、低溫(如凍傷）、電離輻射(如核輻射損傷）、紫外線(如紫外 線損傷)等各種物理性因子，其作用于人體，只要達到一定的強度或一定的作用時間，均可 引起炎癥。其中，外源性化學(xué)性因子包括放射性物質(zhì)、強酸、強堿、強氧化劑或其他化學(xué)物 質(zhì)，其在體內(nèi)達到一定濃度或劑量時會引起炎癥。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的超氧化物歧化酶或所述的 基因或所述的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、宿主菌在制備化妝品和保健食品中的用途。其中， 化妝品優(yōu)選抗衰老、防止皮膚色素沉著的化妝品。
【附圖說明】
[0022] 圖1是野生型耐高溫S0D、突變型耐高溫S0D以及普通S0D的耐熱穩(wěn)定性對比圖；
[0023] 圖2是野生型耐高溫S0D、突變型耐高溫S0D以及普通S0D的酸堿耐受性比較圖； [0024]圖3是普通S0D、突變型耐高溫S0D抗胃蛋白酶降解能力比較圖；
[0025]圖4是普通S0D、突變型耐高溫S0D抗胰蛋白酶降解能力比較圖；
[0026]圖5是突變型耐高溫SOD對結(jié)腸炎的治療作用表型圖；
[0027]圖6是突變型耐高溫S0D對結(jié)腸炎的治療作用(腸腔面積)比較圖；
[0028]圖7是突變型耐高溫S0D對結(jié)腸炎的治療作用（相對腸腔面積)比較圖；
[0029]圖8是突變型耐高溫S0D對結(jié)腸炎的治療效率比較圖；
[0030]圖9是突變型耐高溫S0D對結(jié)腸炎炎癥消退的促進作用表型圖；
[0031]圖10是突變型耐高溫S0D對結(jié)腸炎炎癥消退的促進作用（中性粒細胞數(shù)目）比較 圖；
[0032]圖11是突變型耐高溫S0D對結(jié)腸炎炎癥消退的促進率比較圖；
[0033]圖12是突變型耐高溫S0D對結(jié)腸炎治療作用的組織病理學(xué)分析圖；
[0034]圖13是突變型耐高溫S0D對斑馬魚炎癥的抗炎作用表型圖（注:箭頭所指為炎癥部 位中性粒細胞）；
[0035]圖14是突變型耐高溫S0D對斑馬魚炎癥的抗炎作用（中性粒細胞個數(shù)）比較圖（與 模型對照組相比，**ρ〈〇·〇1，***ρ〈〇·〇〇1);
[0036] 圖15是突變型耐高溫SOD對斑馬魚炎癥的炎癥消退率比較圖（與模型對照組相 比，**ρ〈0·01，***ρ〈0·001);